FCM原理研究生.ppt

第三部分细胞分析学技术,细胞的形态学参数生物学特征,细胞化学成分及含量细胞的功能,定量,固定式,流动式,分析细胞学 年青的交叉学科 激光技术 数字计算机技术 电子物理技术 电子摄像技术 光电测量技术 荧光细胞化学技术 单克隆抗体技术等,FCM History1934 Moldavanl first try（从固定式细胞分析-流动式）1953 Crosland-Taylor:laminar flow（解决难题）1956 Coulter（初次应用）1965 Kamentsky:spectrometer principle(Ortho（开拓）1967 Vandilla and LosAlamos group:Feulgen,DNA Histogram（完善）1969 Hulett:Sorter(Icp-22)1973 B-D:First commercial FCM-FACS I（发展）1979 SSMU:FCM Developing（推广）1980 BJNU:First FCM(FACS III)in ChinaAbout 800 FCMs in China,FCM History1934 Moldavanl first try（从固定式细胞分析-流动式）1953 Crosland-Taylor:laminar flow（解决难题）1956 Coulter（初次应用）1965 Kamentsky:spectrometer principle(Ortho（开拓）1967 Vandilla and LosAlamos group:Feulgen,DNA Histogram（完善）1969 Hulett:Sorter(Icp-22)1973 B-D:First commercial FCM-FACS I（发展）1979 SSMU:FCM Developing（推广）1980 BJNU:First FCM(FACS III)in ChinaAbout 800 FCMs in China,COULTER效应原理,+,电极板,导电液体,FCM History1934Moldavanl first try（从固定式细胞分析-流动式）1953 Crosland-Taylor:laminar flow（解决难题）1956 Coulter（初次应用）1965 Kamentsky:spectrometer principle(Ortho（开拓）1967 Vandilla and LosAlamos group:Feulgen,DNA Histogram（完善）1969 Hulett:Sorter(Icp-22)1973 B-D:First commercial FCM-FACS I（发展）1979 SSMU:FCM Developing（推广）1980 BJNU:First FCM(FACS III)in ChinaAbout 800 FCMs in China,FCM History1934Moldavanl first try（从固定式细胞分析-流动式）1953 Crosland-Taylor:laminar flow（解决难题）1956 Coulter（初次应用）1965 Kamentsky:spectrometer principle(Ortho（开拓）1967 Vandilla and LosAlamos group:Feulgen,DNA Histogram（完善）1969 Hulett:Sorter(Icp-22)1973 B-D:First commercial FCM-FACS I（发展）1979 SSMU:FCM Developing（推广）1980 BJNU:First FCM(FACS III)in ChinaAbout 800 FCMs in China,1979年 国家科委重点项目：研制国内第一台激光流式细胞仪,1982年 国内第一台三参数激光流式细胞仪诞生,1984年国家科委组织科研成果的鉴定验收,1985年 获国家卫生部科技成果乙等奖,1985年-1990年 灵敏度、信噪比、更多参数 流式分选仪研制开发 计算机四参数软件 样品制备、医学生物学应用,什么是流式细胞术(FCM)？FCM是以流式细胞仪为检测手段的一项能快速、精确的对单个细胞理化特性进行多参数定量分析和分选的技术。,特点:流动的 可以是活细胞的 定量的 多参数的 高统计学精度的 分选细胞,第一节 流式细胞术的原理 一 工作原理：FCM是一种在计算机技术支持下的高度自动化的细胞显微荧光脉冲分光光度仪。,一、FCM仪器的一般结构(一)流动室与液流驱动系统(二)激发光源与光束成形系统(三)细胞信号检测与分析处理系统,基本工作原理,速度 轨迹,层流是液体稳定流动的必要条件,管道中层流的形成要满足雷诺数 dV Re=2300，式中、分别为液体的密度和粘滞系数，d和V分别为管道的直径和液体的平均流速。FCM利用层流技术,使细胞流动稳定,并具有自聚焦作用,为细胞分析分选提供技术保证.,(一)流动室与液流驱动系统 层流技术,Injector Tip,荧光信号,激光束,Sheath fluid,流动室,2-3mm方形石英内径200-300m 流速慢,细胞信号大,提高检测灵敏度和精度,小型化。,通过流动室后细胞一个一个排列成单行,依次通过检测区.把流动室称为单细胞流发生器.,流动室,Laser,Flow Cell,孔径50-200m 检测区离喷口200m有分选功能,液流驱动系统（示意图）,流速与压力的关系服从Bernoulli方程，即 P=(1/2)V2(忽略高度的变化)。改变气压,就可获得不同的流速。,流体动力自聚焦排气泡,FACSVantage Fluid System,激光（Laser,light amplification by stimulatedemission of radiation)是一种相干光源。单谱线，高强度.,（二）激发光源与光束成形系统,1-2us,E0,E0,E0,E1,E1,E1,吸收,自发辐射,受激辐射,hv,hv,hv,hv,hv,当物质受到强烈激励,使某一能级的粒子数大量积聚,发生粒子数反分布.如有光束入射,入射光子与粒子发生完全弹性碰撞,使粒子从激发态跃迁到基态同时发生一个光子.光子的能量与入射光子能量相同,有一致的方向和恒定的位相关系,这种发射称受激发射.,球透镜和柱面透镜：20200m 椭圆形光斑，短轴和细胞流平行，长轴与细胞流垂直。,光束成形与细胞受照方式,激发光焦斑,这种椭圆形光斑的检测区保证每个细胞分别受到光照且受检时受到一致的光照 FCM的单细胞照明技术.,光束成形与细胞受照方式,低速 高速不同样本速率形成的样本流,PMT,PMT,PMT,PMT,Dichroic,Filters,Bandpass,Filters,Laser,1,2,3,4,Flow cell,（三）细胞信号检测与分析处理系统,光电管,细胞散色光的波长是与激发光波长一致的.前向散色光信号:光电二极管侧向及荧光信号用光电倍增管,PMT可将散色光及荧光信号转换成电脉冲信号,电脉冲信号通过模数转换器(ADC)量化为数字信号.,信号转换系统:光 电 数字信号,(四)FCM细胞分选装置,488 nm laser,-,Charged Plates,Single cells sortedinto test tubes,FSC Sensor,Fluorescence detector,超声振荡器:20-40KC液流断离点:离喷口5-8mmf=v/4.5d液滴冲电:幅度荷电多少,宽度多少液滴带同时带电.,静电高压偏转板:几千伏电压分选细胞的收集装置:96孔板,载玻片或试管,通道式分选,电荷式分选,细胞分选系统,二、细胞信号的检测与分析,制备好的单细胞悬液经仪器检测区时受到激发光的照射.激光照射在细胞上时可产生散色光信号和荧光信号.,Forward Angle Light Scatter(FSC),(一)细胞散色光信号,细胞对光的散色现象与细胞样品制备无关.,90 Degree Light Scatter(SSC),细胞对光的散色现象与细胞样品制备无关.,FSC,FSC信号的强弱与细胞的大小和活力相关,SSC,SSC信号的强弱与细胞内颗粒多少相关,细胞散色光信号,(二)细胞荧光测量,细胞的自发荧光 未经染色的样品细胞 在激发光的照射下可测到有微弱的荧 光信号.,细胞荧光 经过各种特异染色的细胞在激 发光的照射下可测到较强的荧光信号.,自发荧光信号与特异染色的荧光信号分析图,自发荧光信号,特异染色的荧光信号,细胞荧光信号,AMP,AMP,经过PMT将光学信号转变为电脉冲信号，并增加PMT的电压及增益，可将脉冲信号进行放大。放大方式有两种：,线性放大(Lin):,对数放大(Log):,荧光信号的测量：,荧光检测器检测特定荧光的特定发射波长 线性放大 对数放大,细胞荧光信号,荧光光谱重叠,FITC和PE荧光光谱重叠,Uncompensated vs Compensated,FL1,FL2,利用电子技术或计算机软件等方法将串入相邻荧光通道的信号加以扣除的技术称“荧光补偿”,荧光补偿,荧光补偿,三、FCM测量数据的存贮、显示和分析,（一）FCM数据的存贮（二）FCM数据的显示方式（三）FCM数据的分析,（一）FCM数据的存贮,List Mode方式就是用表格的方式将每一个被测细胞的众多原始测量数据全部记录下来，成为一个数据文件。,1.单参数直方图（Histogram）2.双参数数据显示：二维点图(Dot Plot)等高线图(Contour Plot)二维密度图(Density Plot)假三维图(Pseudo 3D Plot)3.三维图(3D Plot),（二）FCM数据的显示方式,.单参数直方图的显示,以分布直方图(distribution histogram)来显示，横轴为该参数测量强度相对值，单位是道数。强度分布可以是线性的，也可以是对数的。纵轴一般是细胞数或细胞出现的频数。,Single-Parameter Histogram Displays,单参数直方图的显示,.双参数数据的显示,细胞双参数测定不仅能提供二个参数各自与细胞数量的关系，更重要的是获得了这二参数之间的相关关系，其中包含了更多的生物学信息。双参数数据显示最常用的是二维的散点图(Dot Plot)。在二维图上，X轴代表第一个测量参数，Y轴代表第二个测量参数。每个点代表一个细胞.,Two-Parameter Data Displays,点图(dot plot),用等高线来表示细胞数，在一条等高线上细胞数相同，不同的等高线上细胞数不同。,二维等高图,纵轴与横轴分别代表被测细胞的两个测量参数,Z轴为细胞数。,假三维等高图,.多参数数据的显示,在单一图上同时显示多参数是不可能的。实际工作中是用若干个单参数直方图和各种不同组合的双参数数据显示来反映各种信息的。多参数测量另一重要意义是通过有关参数进行“设门”分析(gating analysis)可以是单参数设门，也可以是双参数设门。单参数设门调出双参数显示简称“一调二”。不难理解也有“一调一”和“二调一”和“二调二”等。,Multiple-Parameter Data Displays,三维坐标匀为参数（散射光或荧光）而非细胞数。,多参数直方图,一般利用所得参数的两两组合并利用设门（Gate)技术，来分析参数之间的相互关系。,多参数显示,多参数显示,通过双参数调阅单参数,通过单参数调阅双参数,.单参数分布直方图的设区分析,.细胞DNA含量分布直方图的数据分析,.双参数数据的设门分区分析,.多参数数据的分析,（三）FCM数据的分析,.单参数分布直方图的设区分析,这是单参数数据分析中最简单的一种方法。由于FCM一次测量的细胞数多，配合设门和调用等手段获得感兴趣的细胞参数分布直方图。这种统计分布直方图一般可直观地反映出众多有用的信息。,.单参数分布直方图的设区分析,通过细胞DNA含量测定，了解细胞增殖群体中G0/G1、S、G2/M细胞各占的比例，进而分析其细胞动力学各参数。这是FCM的重要应用之一。细胞DNA含量分布直方图的数据分析通常有两种方法，作图分析法和计算机拟合法(Curve fitting)。,.细胞DNA含量分布直方图的数据分析,细胞DNA含量分布直方图的数据分析,细胞DNA含量分布直方图的数据分析,计算机拟合法适用范大，应用中要注意以下一些方面：1）FCM仪器CV值与细胞荧光染色的好坏会 直接影响曲线拟合的结果。2）在细胞群体中数量较少的细胞亚群，如G2/M细胞群的分析误差一般大于细 胞数量多的亚群。3）曲线拟合有时会出现偏离生物学意义的 分析结果。这种情况下，可改变参量或 选用其他数学模型重新分析。,.双参数数据的设门分区分析,在双参数的显示图上，细胞结构和细胞功能相同的细胞亚群总表现为集中分布的趋势，不同细胞亚群有其各自的分布区域。设门分区可以是方形、矩形、圆形、椭园形甚至各种不规则图形，按细胞亚群实际的分布情况而定。,点图 纵轴与横轴分别代表被测细胞的两个测量参数,在图中每一个点代表一个细胞,双参数数据的设门分区分析,多参数数据分析的关键在于如何正确通过设门和调用获取有价值的单参数显示和/或双参数显示。由于多参数相关测量包含的信息量大，故经常会用多个单参数和/或双参数显示来全面反映其中的各种信息。由于样品细胞的种类、处理过程、染色方法等的差异，不可能规定不变的数据处理步骤。细致认真的数据处理可获得大量的正确结果。,.多参数数据的分析,重点提要:,流式细胞术 FCM如何采用层流技术？FCM细胞散色光信号FCM的荧光补偿FCM的数据储存方式FCM的不同显示方式,流式细胞术样品制备,Flow Cytometry Sample Preparation,流式细胞术操作流程：,FCM的细胞样品制备技术三个部分：一、单分散细胞悬液制备二、选择性分离细胞亚群三、细胞荧光染色,流式细胞术对细胞的分析检测 必须 基于单个细胞的基础上，这是 流式细胞术带来的特殊要求。,一、单个分散细胞悬液的制备技术,（一）实体组织的单细胞悬液的制备（二）石蜡包埋组织单细胞悬液的制备,常用的分散细胞的方法如下 1、酶消化法 2、机械法 3、化学试剂处理法,（一）实体组织的单细胞悬液的制备,（1）原理（2）常用的酶类试剂（3）酶反应的条件（4）酶消化法的一般步骤,1、酶消化法：,（）原理：这种方法是利用酶的蛋白质大分子不能进入活细胞膜，但能够破坏细胞与细胞之间的胶原纤维，水解细胞间的粘多糖成分，分解细胞间的细胞紧密连结装置的蛋白性物质，而使细胞能从组织块上游离到悬浮液中，制备成细胞悬液。,、酶消化法,A.蛋白酶类：如胃蛋白酶、胰蛋白酶、链蛋白酶等，其中胰蛋白酶(Trypsin)最常用。B.胶原酶(Collagenase）：胶原酶能降解几种分子类型的胶原。其它常用的酶还有弹性蛋白酶，透明质酸酶和木瓜蛋白酶等。不同类型的组织其化学组成不相同使用不同种类的酶，见表1-1。,（）常用的酶类剂,表1-1 酶种类的选择胰蛋白酶 链蛋白酶 胶元酶人结肠肉瘤 人前列腺 小鼠骨髓瘤大鼠肾脏 人瘤腮腺 小鼠乳腺肿瘤人扁桃体 大鼠乳腺 小鼠睾丸仓鼠前列腺 仓鼠肾脏 大鼠睾丸小鼠肝脏 仓鼠胰腺 人脾脏仓鼠腮腺 人何杰金氏肿瘤大鼠结肠肉瘤,为使组织细胞分散下来，须注意条件的选择和影响因素：A.配制酶溶液试剂时要兼顾酶反应的适宜条件与活细胞要求的生理环境，其中包括渗透压，pH值(缓冲液)，各种离子浓度，酶激动剂等。B.酶溶液的适用浓度：胃蛋白酶 0.5%胶原酶 0.1%胰蛋白酶 0.25%(含1-10g/ml DNase),（）酶反应的条件,C.酶消化过程的最佳温度与持续时间：37,15-20分钟，不同组织不同酶而异。二次消化反复数次,直至组织块完全消失。每克组织10-15ml。,（）酶反应的条件,D.终止酶消化反应的方法和措施：加酶抑制剂（如大豆胰蛋白酶抑制剂等）；降低酶反应温度，将细胞悬液管移至冰水浴中；对于蛋白酶，加入少量血清以减弱酶对细胞的不利影响。通过反复离心漂洗，移去酶消化液，彻底终止酶消化过程等。,（）酶反应的条件,A.新鲜组织块放入冰冷的培养液（或生理盐水）。B.坏死部分，纤维、脂肪及血管等剔除。C.剪为1.0mm3大小于冰冷的培养液(或生理盐水)。D.漂洗剪碎的组织块，以洗去剪碎的细胞碎片。E.加入酶消化液（一般g组织加消化液10-15ml)。F.消化15-20分钟(37，间断振荡或吹打)，消化 时间视不同组织，不同种类的酶而异。G.终止消化，收集、过滤、低速离心除去碎片。H.单细胞悬液进行荧光染色，上机检测或保存备用。,（）酶消化法的一般程序和步骤：,有剪碎法、网搓法、研磨法等 它是利用机械方法，物理方法给予组织 较大的压力或用超声振荡使细胞从组织间 分散开来。,.机械法：,贴壁粘连作用钙镁离子结合掉，从而使细胞分散。常用试剂有EDTA、EGTA、TPB等。,.化学试剂处理法：,EDTA是一种螯合剂。实际运用时采用螯合剂加酶学法（主要是采用胰蛋白酶）。这样的分散细胞方法效果要比单独采用化学试剂法好。其他常用的化学试剂还有Triton-x-100，四苯硼等。,机械法往往常成严重的细胞损伤，而结果却是较低的细胞产量。如用低速离心去碎片，用尼龙网过滤团块等，也可利用电子学技术处理的方法排除团块和碎片的干扰。酶学法、化学法对实体组织的分散效果较理想，但会造成所测化学成份的不良影响。FCM所测细胞是单个分散状态；对细胞团块，细胞碎片尽可能少；细胞的活性不受损害，以保证下一步的荧光染色处理不受影响。,小结,检测石腊包埋组织，对细胞成份及特性进行定量定性分析是近年来流式细胞术在临床肿瘤学的应用和基础生物学的应用，因此，石腊包埋组织单细胞悬液制备技术的建立使大量存档的临床资料重新得到研究与利用，从而扩大了流式细胞术的应用范围。,（二）石腊包埋组织单细胞悬液的制备,常用的方法有以下几种：,.利用细胞之间密度或体积的差异分离,.利用细胞的吸咐力特性分离,.利用单克隆抗体分离细胞亚群,.利用选择性破坏和保留一部分细胞亚群,.利用FCM分析技术区分细胞亚群,.利用流式细胞分选术分选细胞亚群,二、选择性分离细胞亚群,（1）自然沉降法（2）密度梯度离心法，电泳法，离心鼓淘汰法。用淋巴细胞分离液根据各细胞亚群的比重不 同可以分离出淋巴细胞、粒细胞等。,.利用细胞之间密度或体积的差异分离,（1）玻璃和磁铁吸咐法：纯化淋巴胞（2）花环沉降法：T、B淋巴细胞的化（3）吸咐法：纯化单核细胞,.利用细胞的吸咐力特性分离,.利用单克隆抗体分离细胞亚群,阳性选择,阴性选择,MACS-Magnetic CellSorting 磁珠分离,氯化铵选择性破坏红细胞,.利用选择性破坏和保留一部分细胞亚群,用散射光信号区分淋巴、粒、单核细胞,.利用FCM分析技术区分细胞亚群,干细胞（CD34+）的分选,.利用流式细胞分选术分选细胞亚群,488 nm laser,-,Charged Plates,Single cells sortedinto test tubes,FALS Sensor,Fluorescence detector,分离结果的验证指标有两方面：收获率和纯度 收获率 是指分离后所得的细胞亚群数占原细胞样品中该亚群细胞数的百分比。纯度 是指分离后的样品中该亚群细胞所占的百分比。,小结,三、细胞荧光染色技术,流式细胞术快速分析单细胞的各种生物学特性和各种生化成份并定量测定这些参数是通过荧光细胞化学方法实现的。,（一）细胞化学的定义和原则（二）细胞悬液中荧光细胞化学方法的特点（三）荧光细胞化学的评价标准（四）FCM荧光细胞化学的分类（五）细胞DNA荧光染色（六）细胞RNA荧光染色（七）细胞蛋白质荧光染色（八）其它荧光染色方法,三、细胞荧光染色技术,.荧光细胞化学过程的特异性 FCM的荧光细胞化学过程要求有足够的 特异性，荧光染料与细胞成分是否为特异 性结合。严格控制各种反应条件是保证反 应特异性的重要因素。,（三）荧光细胞化学的评价标准,.荧光细胞化学的化学定量关系 在相同的条件下，荧光反应产物（荧光强度）与所研究的生化成份的含量或活性之间有严格的化学定量关系。,荧光染色定量关系,荧光染色的特异性,1.共价结合的反应过程 Feulgen反应，FITC与蛋白质分子中的 自由氨基形成的硫碳氨基键等。2.插入性结合方式的反应过程 EB，PI，7-氨基放线菌素D(7-AAD)等。结合紧密、稳定，染料不会丢失脱落，简便，特异性较高，被广泛应用。3.结构亲合方式的反应过程 吖啶橙与核酸单链结合，派若宁Y与单 链核酸结合等。反应过程易受溶液pH的 影响。结合极弱,易丢失。,（四）FCM荧光细胞化学的分类,表1-2 常用荧光探针的光谱特性 分类 染料 激发谱 发射谱 FITC 紫 蓝 绿 TRITC 蓝 绿 红 XRITC 绿 黄 红 Texas Red 绿 黄 红 Phycocyanin 绿 黄 红 Allophycocyanin 红 红,细胞表面标记染料,Propidium Iodide 蓝-绿 红 Acridine Orange 蓝 绿 Ethidium Bromide 蓝-绿 红 Hoechst33258/33342 紫外 蓝 DAPI 紫外 蓝 DIPI 紫外 蓝 Mithramycin 紫-蓝 绿 Chromomycin A3 紫-蓝 绿 Acriflavine 蓝 绿-黄,分类 染料 激发谱 发射谱,细胞DNA染料,细胞RNA Acridine Orange 蓝 绿 染料 Pyronine Y 蓝-绿 红 FITC 紫-蓝 绿 TRITC 蓝-绿 红 细胞蛋 Sulforhodamine 101 蓝或绿 红 白质 LN 紫外 蓝 染料 DANS 紫外 绿 SITS 紫外 蓝,分类 染料 激发谱 发射谱,双或多参数荧光抗体的组合标记,FITC+PE 488 525、575 绿色、橙色FITC+T red 488 525 绿色 568 615 红色FITC+PeCy5 488 525、675 绿色、红色FITC+ECD 488 525、625 绿色、橙红色F+P+PeCy5 488 525、575、675 绿、橙、红色F+ECD+PeCy5 488 525、575、675 绿、橙红色、红色F+P+APC 488 525、575 绿色、橙色 633 670 红色,荧光染料 激发波长（nm)发射波长（nm)颜色,1.溴化乙啶(EB)和碘化丙啶(PI)荧光试剂及其染色程序:这两种荧光染料的理化特性类似，是平面环状结构的分子，分子量300左右。同属插入性荧光染料，可选择性地定量插入核酸双螺旋结构的硷基对之间。没有DNA和RNA选择性 不能进入活细胞膜，可以鉴别死活细胞。,（五）细胞DNA荧光染色,荧光探针为异硫氰酸荧光素(Fluorescein isothiocyanate，FITC)。是一种酸性荧光 染料，以共价键结合方式与蛋白质带有正电荷的位点结合。它的激发波长峰值为488nm左右，发出亮绿色荧光。受pH值的影响较大；受自发荧光的干扰，必需做对照来排除本底的干扰。,（七）细胞蛋白质荧光染色,.免疫荧光染色(1)基本原理 抗原抗体特异性结合 直接免疫与间接免疫荧光染色法(2)样品制备方法与步骤 2.BrdUrd和DNA双标记染色 3.细胞内钙离子荧光标记 4.细胞内pH,（八）其它荧光染色方法,2.BrdUrd和DNA双标记染色 溴脱氧尿嘧啶核苷(Bromodeoxyuridine，BrdUrd)是胸苷的一种类似物。它可以替代胸腺嘧啶掺入到细胞新合成的DNA分子中，成为S期细胞的一种标记物。流式细胞术采用抗BrdUrd单克隆抗体免疫荧光和PI双参数检测细胞，不仅可检测一个细胞群体的动力学参数和DNA含量，同时可以了解不同细胞的DNA合成能力高低。,流式细胞术操作流程：,重点题要,酶消化法应注意哪些条件?常用的单分散细胞的方法有哪些?荧光细胞化学过程的特异性荧光细胞化学的化学定量关系收获率和纯度,谢谢!,