DNA电泳实验步骤.ppt

DNA凝胶电泳DNA agarose gel electrophoresis,实验七,琼脂糖凝胶电泳是常用的用于分离、鉴定DNA、RNA分子混合物的方法，这种电泳方法以琼脂凝胶作为支持物，利用DNA分子在泳动时的电荷效应和分子筛效应，达到分离混合物的目的。DNA分子在高于其等电点的溶液中带负电，在电场中向阳极移动。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即分子本身的大小和构型是主要的影响因素。DNA分子的迁移速度与其相对分子量成反比。不同构型的DNA分子的迁移速度不同。如环形DNA分子样品，其中有三种构型的分子：共价闭合环状的超螺旋分子（cccDNA）、开环分子(ocDNA)、和线形DNA分子(IDNA)。这三种不同构型分子进行电泳时的迁移速度大小顺序为:cccDNAIDNAocDNA 当用低浓度的荧光嵌入染料溴化乙啶(Ethidium bromide,EB)染色，在紫外光下至少可以检出1-10ng的DNA条带，从而可以确定DNA片段在凝胶中的位置。此外，还可以从电泳后的凝胶中回收特定的DNA条带，用于以后的克隆操作。,实验原理,实验材料：PCR产物,植物基因组DNA,质粒DNA等，购买 或自行提取纯化。实验试剂：5TBE电泳缓冲液：6电泳载样缓冲液：0.25 溴粉蓝，40(w/v)蔗糖水溶液，贮存于 4。溴化乙锭(EB)溶液母液：将EB配制成10 mg/mL，用铝箔或黑纸包裹容器,储于室温即可。,实验材料和试剂,微波炉,实验仪器,凝胶电泳槽,凝胶成像系统,实验步骤,取5TBE缓冲液20mL加水至200mL，配制成0.5TBE稀释缓冲液，待用。胶液的制备：称取0.4g琼脂糖，置于200mL锥形瓶中，加入50mL 0.5TBE稀释缓冲液，放入微波炉里加热至琼脂糖全部熔化，取出摇匀，此为0.8琼脂糖凝胶液。加热过程中要不时摇动，使附于瓶壁上的琼脂糖颗粒进入溶液。胶板的制备：将有机玻璃胶槽两端分别用橡皮膏紧密封住。将封好的胶槽置于水平支持物上，插上样品梳子，注意观察梳子齿下缘应与胶槽底面保持1mm左右的间隙。向冷却至50-60的琼脂糖胶液中加入溴化乙锭(EB)溶液使其终浓度为0.5g/mL。用移液器吸取少量融化的琼脂糖凝胶封橡皮膏内侧，待琼脂糖溶液凝固后将剩余的琼脂糖小心地倒入胶槽内，使胶液形成均匀的胶层。待胶完全凝固后拨出梳子，注意不要损伤梳底部的凝胶，然后向槽内加入0.5TBE稀释缓冲液至液面恰好没过胶板上表面。,加样：取10L DNA样品与2L 6上样液混匀，用微量移液枪小心加入样品槽中。若DNA含量偏低，则可依上述比例增加上样量，但总体积不可超过样品槽容量。每加完一个样品要更换tip头，以防止互相污染，注意上样时要小心操作，避免损坏凝胶或将样品槽底部凝胶刺穿。电泳：加完样后,合上电泳槽盖，立即接通电源。控制电压保持在60-80V，电流在40mA以上。当溴酚蓝条带移动到距凝胶前沿约2cm时，停止电泳。染色：未加EB的胶板在电泳完毕后移入0.5g/mL的EB溶液中，室温下染色20-25min。观察和拍照：在波长为254nm的长波长紫外灯下观察染色后的或已加有EB的电泳胶板。,琼脂糖通常用水平装置在强度和方向恒定的电场下电泳。琼脂糖主要在DNA制备电泳中作为一种固体支持基质，其密度取决于琼脂糖的浓度。在电场中，在中性pH值下带负电荷的DNA向阳极迁移，其迁移速率由下列多种因素决定：1、DNA的分子大小 2、琼脂糖浓度 3、DNA分子的构象 4、电源电压 5、嵌入染料的存在 6、离子强度影响,DNA存在处显示出肉眼可辨的桔红色荧光条带,EB是强诱变剂并有中等毒性，配制和使用时都应戴手套，并且不要把EB洒到桌面或地面上。凡是沾污了EB的容器或物品必须经专门处理后才能清洗。沾染了EB的垃圾要专门处理后才可丢弃。当EB太多,胶染色过深，DNA带看不清时，可将胶放入蒸馏水冲泡，30min后再观察。制备凝胶时，倒胶的温度不可太低，否则凝固不均匀：速度也不可太快，否则容易出现气泡。,实验注意事项,琼脂糖凝胶电泳中DNA分子迁移率受哪些因素的影响？,思考题,