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第四章 DNA的复制 Chapter 4 DNA Replication,第四章 DNA 复 制DNA Replication,1 引言-基因组复制与细胞分裂的关系2 复制子3 DNA复制的几种形式4 DNA聚合酶5 原核生物DNA复制的基本过程6 真核生物DNA复制7 DNA复制的调控8 小 结,重点内容：几个重要概念：DNA的复制、复制子、复制眼、复制叉、DNA聚合酶、DNA的半保留复制、DNA的半不连续复制、DNA的先导链、DNA的后随链、冈崎片段；不同生物基因组复制子数目；线性DNA复制末端问题的提出及解决方案；-复制、滚环复制及D-环复制的机制；大肠杆菌DNA聚合酶 I、II、III 的性质比较，DNA聚合酶与缺口平移法制备探针；DNA复制的起始、延伸及终止。了解内容：基因组复制与细胞分裂的关系；复制叉移动方向的确定；真核生物DNA聚合酶的种类及各自的功能；DNA复制的调控。,1 引言-基因组复制与细胞分裂的关系,细胞在每次分裂的过程中，整个基因组都必须精确地复制一次。如何保证这一点？两个原则(1)DNA复制的启动决定了细胞的进一步分裂;(2)复制过程完成前，细胞是不会发生分裂的。,2 复制子(replicon),2.1 复制子的定义2.2 不同生物复制子的数目2.3 复制眼概念2.4 复制叉概念及其移动方向的实验确定2.5 复制的模式-起点、方向和速度,2.1 复制子的定义,DNA中发生一次复制的单位称为复制子(replicon)。复制子是根据它含有复制所需的控制元件来定义的，在复制启动位点具起始点（origin)，在复制终止位点具终点（terminus)。起始点仅作用于所在复制子。注：在每个细胞周期中，每个复制子发生一次复制，且只发生一次。,质粒一般是一个自主环状的DNA基因组，构成一个独立复制子；原核生物基因组中一般只含一个复制子，在唯一的起始点启动就会引起整个基因组复制；真核生物基因组含多个复制子（一般40-100kb/个）。,2.2 不同生物复制子的数目,2.3 复制眼概念,复制眼：在一个长的未复制区域内DNA已经复制的区域,Replication eye,复制叉:双螺旋DNA两条亲本链分开使复制能进行的部位。,2.4 复制叉的概念及其移动方向的确定,复制叉移动方向的确定,放射性自显影法：对于大基因组内的不确定区域，两次连续的放射脉冲可以用来标记复制的移动。如果一个脉冲比另一个脉冲强，我们可以用相对的标记强度来区分，这些可用放射自显影观察。单向复制：在复制眼的一端，一种类型的标记后紧跟着另一种标记；双向复制：在复制眼的两端产生一种（对称的）模式。在真核生物中普遍存在。,2.5 复制的模式-起点、方向和速度,单起点、单方向,多起点、单方向,单起点、双方向,多起点、双方向,3 DNA复制的几种形式,3.1 线性DNA双链的复制3.2 环状DNA双链的复制,3.1 线性DNA双链的复制,3.1.1 线性DNA复制的具体表现3.1.2 线性DNA复制时末端问题的提出3.1.3 线性DNA复制时末端问题的解决方案,3.1.1 线性DNA复制的具体表现,3.1.2 线性DNA复制时末端问题的提出,所有已知的核酸聚合酶，无论是DNA聚合酶还是RNA聚合聚合酶都只从5端向3端移动，新链的合成方向与聚合酶移动方向一致，即只能是5 3；而对于DNA的合成必需一段引物的存在，体内DNA复制时，由一段RNA引物起始DNA合成，起始后它必须切除，切除后，5端如何起始呢？这就提出了线性DNA末端复制的问题。,复制能在新合成链的3端结束，它如何在5端启动呢？,3.1.3 线性DNA复制时末端问题的解决方案,(1）通过将线性复制子转变为环状或多聚分子。如噬菌体：滚环产生多聚复制子）；(2）某种蛋白质可能会介入，在真正的末端上启动。几种线性病毒核酸具有与5端碱基共价结合的蛋白质，其中了解最清楚的例子是腺病毒 DNA)。(3）DNA可形成特殊的结构，如在末端形成发夹。使分子没有游离末端。草履虫（Paramecium）的线性线粒体DNA的复制中就形成了一种交联；(4）末端是可变的，而不是精确确定的。真核生物染色体可能采用这种方式，在这种情况下，DNA末端的短重复序列的拷贝数改变（如端粒的复制）；,（1）通过将线性复制子转变为环状或多聚分子,The rolling circle replicates DNA,Phage,A rolling circle appears as a circular molecule with a linear tail by electron microscopy.,Adenovirus terminal protein binds to the 5 end of DNA and provides a C-OH end to prime synthesis of a new DNA strand.,（2）某种蛋白质介入而在真正的末端启动复制,Adenovirus DNA replication is initiated separately at the two ends of the molecule and proceeds by strand displacement.,（3）DNA末端形成特殊结构,A typical telomere has a simple repeating structure with a G-T-rich strand that extends beyond the C-A-rich strand.The G-tail is generated by a limited degradation of the C-A-rich strand.,（4）末端长度可变,A loop forms at the end of chromosomal DNA.,The 3 single-stranded end of the telomere(TTAGGG)n displaces the homologous repeats from duplex DNA to form a t-loop.,Watching flash,3.2 环状DNA的复制,3.2.1-复制3.2.2 滚环复制3.2.3 D-环复制,3.2.1-复制 replication by-structure,3.2.2 滚环复制replication by rolling cycles structure,X174噬菌体由一个单链环状DNA组成，这条链称为正（+）链；合成的互补链称为负（一）链。双链体的复制以滚环复制方式进行。,The A protein is cis-acting,Phage X174The replication by rolling cycle structure,3.2.3 D-环复制Replication by displacement loop structure,D-环复制（Replication by displacement loop structure),4 DNA聚合酶,4.1 大肠杆菌DNA聚合酶的种类及其功能4.2 真核生物DNA聚合酶的种类及其功能4.3 DNA聚合酶所具有的共同结构,4.1 大肠杆菌DNA聚合酶的种类及其功能,SOS 修复,4.1.1 大肠杆菌DNA聚合酶 I、II、III 的性质比较,（1）DNA聚合酶 I 103 kDa的单链多肽，可以被蛋白酶切成两段，C端的2/3包括聚合酶活性位点；N端的1/3包含核酸外切酶校正活性（一次可切除1-10个碱基）。（2）利用DNA聚合酶 I 进行缺口平移法制备探针的基本原理,4.1.2 DNA聚合酶 I 与缺口平移法制备探针,Nick translation replaces part of a pre-existing strand of duplex DNA with newly synthesized material.,DNase,4.2 真核生物DNA聚合酶的种类及其功能,真核生物由不同DNA聚合酶分别负责起始和延伸,三种细胞核DNA复制酶具有不同的功能:DNA polymerase 起始新链合成DNA polymerase 延伸先导链DNA polymerase 可能与后随链合成有关，也可能具有其他功能,4.3 DNA聚合酶所具有的共同结构,许多DNA聚合酶有一个由三个结构域组成的大裂隙，类似于手形。,The common organization of DNA polymerases has a palm that contains the catalytic site,fingers that position the template,a thumb that binds DNA and is important in processivity,an exonuclease domain with its own active site,and an N-terminal domain.,5 原核生物DNA复制的基本过程,5.1 DNA复制的起始5.2 DNA合成链的延伸5.3 DNA复制的终止,5.1.1 单链DNA的产生5.1.2 3-OH引发末端的产生5.1.3 复制复合体的形成,5.1 DNA复制的起始,5.1.1 单链DNA的产生,解旋酶(helicase):使DNA的两条链分开，它通常利用ATP水解来提供必需的能量；,拓扑异构酶（DNA Topisomerase）,拓扑异构酶的种类分为型和型。原核拓扑构酶：MW=100kD，单肽链，含34个Zn。作用是暂时切断一条DNA链，形成酶-DNA共价中间物而使超螺旋DNA松弛，然后再将切断的单链DNA连接起来。每次改变一个连环数。,原核拓扑构酶作用机制：酶与DNA结合使双链解旋；使一条链切开，但酶与切口的两端结合阻止了螺旋的旋转；酶使另一条链经过缺口，然后再将两断端连接起来；酶从DNA上脱落，两条链复原，得到的DNA比原来少一个负超螺旋。,拓扑异构酶 拓扑异构酶也称旋转酶。广泛存在于各种生物中。使正超螺旋转化为负超螺旋，每次改变两个连接数。,单链结合蛋白（single-strand binding protein):单链DNA结合，阻止其再形成双链体状态,X174 噬菌体的DNA在三种功能蛋白先后作用下分开成为单链：在复制起始点，噬菌体A蛋白使病毒（+）链产生缺口。Rep蛋白提供解旋酶活性，它使两链分离。SSB包绕单链形成稳定的单链形式。,Three proteins unwind X174 DNA,5.1.2 3-OH引发末端的产生,多种方法可以产生3-OH末端,1),3),2),起始需要解旋酶、单链结合蛋白和引发酶,5.1.3 复制复合体的形成,5.2 DNA合成链的延伸,5.2.1 半保留复制合成两条新的DNA链5.2.2 DNA的合成是半不连续的5.2.3 连接酶将冈崎片段连接在一起5.2.4 前导链和后随链的协调合成 5.2.5 DNA复制忠实性的控制,(1)半保留复制的概念,DNA在复制时，两条链解开分别作为模板，在DNA聚合酶的催化下按碱基互补的原则合成两条与模板链互补的新链，以组成新的DNA分子。这样新形成的两个DNA分子与亲代DNA分子的碱基顺序完全一样。由于子代DNA分子中一条链来自亲代，另一条链是新合成的，这种复制方式称为半保留复制(semiconsertive replication)。,5.2.1 半保留复制合成两条新的DNA链,(2)半保留复制实验证据（Meselson-Stahl),1958年Meselson&stahl用同位素（15N）示踪标记加密度梯度离心技术实验,该实验跟踪了生长了三代的大肠杆菌，证明了DNA是采取半保留的方式进行复制。,5.2.2 DNA的合成是半不连续的（semidiscontinuous replication),DNA 复制在合成先导链（leading strand)时是连续的；而在合成后随链(lagging strand)时是先形成小片段（Okazaki fragment），随后再将它们连接而成大片段。因后随链是不连续合成的而先导链是连续合成的，所以我们称之为半不连续复制（semidiscontinuous replication)。,两条新链具有不同的特征,The two new DNA strands have different features,Okazaki fragment,5.2.3 连接酶（Ligase)将Okazaki fragment连接在一起,5.2.4 前导链(Leading strand)和后随链(lagging strand)的协调合成,5.2.5 DNA聚合酶控制复制的忠实性,DNA聚合酶造成的复制错误可分为两类：移码（frameshift):指一个核苷酸的插入或缺失。替换（substitution):指掺入错误核苷酸（不正确配对）Note:DNA聚合酶通常具有3-5核酸外切酶活性，可以切除错配碱基；通过校正机制，复制忠实性还可提高100倍。(10-310-8-10-10),细菌的DNA聚合酶仔细检查延长链末端的碱基对，如果是错误的会予以切除。,DNA polymerases have exonuclease activity,修复会把含损伤碱基的一小段DNA替换掉,5.3 DNA复制的终止,一般说来，链的终止不需要特定的信号，也不需要特殊的蛋白质来参与，到达终止位点后，DNA聚合酶离开DNA双链，终止发生。,真核生物DNA复制 P47-48,7 DNA复制的调控 P48-50,8 小 结,复制子、复制眼、复制叉的概念线状DNA分子复制时末端问题的解决DNA通过半保留半不连续方式合成细菌和真核生物都有一种以上的DNA聚合酶。,DNA合成包括：起始、延伸和终止三个阶段,起始(initiation)：涉及一种蛋白质复合物，它识别复制起始点(origin)。在DNA合成之前，母链必须分开，并（短暂地）保持单链状态，然后在复制叉处起始子链的合成；延伸(elongation)：由另一个蛋白质复合体完成。只有当蛋白质复合体和DNA在复制处的特殊结构结合时，复制体(replisome)才存在，在复制体延DNA移动时，母链分开而子链合成；终止（termination)：在复制子末端，终止反应是必需的。终止后，加倍的染色体必须分开。,