DNA和RNA提取原理和方法.ppt

核酸提取及常见问题分析,主讲人：刘召华 唐维（修改）,第一部分：DNA提取方法简介,第二部分：DNA提取常见问题、原因分析及其对策,内容,第三部分：RNA提取方法简介,第四部分：RNA提取及其RT-PCR常见 问题、原因分析及其对策,核酸是遗传信息的载体，是最重要的生物信息分子，是分子生物学研究的主要对象，因此核酸的提取是分子生物学实验技术中最重要、最基本的操作。,前言,第一部分：DNA提取方法简介,第二部分：DNA提取常见问题、原因分析及其对策,第三部分：RNA提取方法简介,第四部分：RNA提取及其RT-PCR常见 问题、原因分析及其对策,第一部分：DNA提取方法简介,DNA提取的几种方法,基因组DNA的提取,CTAB法SDS法其它,DNA提取的几种方法,非基因组DNA的提取,质粒DNA的提取,碱裂解法 煮沸法,线粒体、叶绿体DNA的提取,差速离心结合SDS裂解法,基因组DNA CTAB法,CTAB法原理（植物DNA提取经典方法）,CTAB（hexadecyltrimethylammonium bromide，十六烷基三甲基溴化铵），是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，并与核酸形成复合物。具有从低离子强度的溶液中沉淀核酸和酸性多聚糖的特性，在这种条件下，蛋白质和中性多聚糖仍留在溶液里该复合物在高盐溶液中（0.7mol/L NaCl）是可溶的，通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。,注：CTAB溶液在低于15 时会形成沉淀析出，因此在将其加入冰冷的 植物材料之前必须预热，且离心时温度不要低于15。,CTAB提取缓冲液的经典配方,Tris-HCl（pH8.0）提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏；EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase活性；NaCl 提供一个高盐环境，使DNP（脱氧核糖核蛋白）。CTAB溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离；-巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除,基因组DNA CTAB法,褐变,CTAB提取缓冲液的改进配方,PVP（聚乙烯吡咯烷酮）是酚的络合物，能与多酚形成一种不溶的络合物质，有效去除多酚，减少DNA中酚的污染；同时它也能和多糖结合，有效去除多糖。,基因组DNA CTAB法,PVP（聚乙烯吡咯烷酮）,PVP 按其平均分子量大小分为四级，习惯上常以K值表示，不同的K值分别代表相应的PVP平均分子量范围。K值实际上是与PVP水溶液的相对粘度有关的特征值，而粘度又是与高聚物分子量有关的物理量，因此可以用K值来表征PVP的平均分子量。通常K值越大，其粘度越大，粘接性越强。在研磨过程中加入PVP，其中的CO-N=基有很强的结合多酚的能力，从源头上减少了酚类被氧化的机会。同时向抽提液中加入还原剂-巯基乙醇，后者能打断多酚氧化酶中的二硫键，使多酚不易被氧化，随后经抽提而去除。,CTAB法流程图,植物材料,裂解液,上层溶液,液氮研磨,抽提,细胞裂解,干燥溶解,离心洗涤,酒精沉淀,DNA溶液,基因组DNA CTAB法,SDS法原理,基因组DNASDS法,SDS是一种阴离子去垢剂，在高温（5565）条件下能裂解细胞，使染色体离析，蛋白变性，释放出核酸；提高盐(KAc或NH4Ac)浓度并降低温度（冰浴），使蛋白质及多糖杂质沉淀，离心后除去沉淀；上清液中的DNA用酚/氯仿抽提，反复抽提后用乙醇沉淀水相中的DNA。,SDS法DNA提取缓冲液,2.65 水浴 60min,其间缓慢摇动几次。3.加入150ul 的5mol/LKac,混匀,冰浴15min 左右,SDS法流程图（以动物组织为例）,基因组DNASDS法,基因组DNA其它方法,物理方式：玻璃珠法、超声波法、研磨法、冻融法化学方式：异硫氰酸胍法、碱裂解法生物方式：酶法,根据细胞裂解方式的不同有：,基因组DNA其它方法,吸附材料结合法：,根据核酸分离纯化方式的不同有：,硅质材料阴离子交换树脂磁珠,高盐低pH值结合核酸，低盐高pH值洗脱。快捷高效。,低盐高pH值结合核酸，高盐低pH值洗脱。适用于纯度要求高的实验。,磁性微粒挂上不同基团可吸附不同的目的物，从而达到分离目的。,基因组DNA其它方法,浓盐法：有机溶剂抽提法：密度梯度离心法：,利用RNP和DNP在盐溶液中溶解度不同，将二者分离,有机溶剂作为蛋白变性剂，同时抑制核酸酶的降解作用,利用不同内容物密度不同的原理分离各种内容物,质粒DNA碱裂解法,碱裂解法原理,染色体DNA比质粒DNA分子大得多，且染色体DNA为线状分子，而质粒DNA为共价闭合环状分子；当用碱处理DNA溶液时，线状染色体DNA容易发生变性，共价闭环的质粒DNA在回到中性pH时即恢复其天然构象；变性染色体DNA片段与变性蛋白质和细胞碎片结合形成沉淀，而复性的超螺旋质粒DNA分子则以溶解状态存在液相中，从而可通过离心将两者分开。,质粒DNA碱裂解法,碱裂解法流程图,对数期菌体,溶液III中和,溶液I充分重悬,溶液II裂解,上清液,抽提,离心洗涤,酒精沉淀,干燥溶解,沉淀,质粒DNA溶液,SDS碱裂解法提取质粒DNA中溶液1的成分及作用,溶液 50mM 葡萄糖/10mM EDTA/25mM Tris-HCl，pH=8.0 葡萄糖增稠，使悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部；EDTA 抑制DNase的活性。这一步溶液中还可以加入RNase，不受EDTA影响，并且可以在后续步骤中被除去 溶液 0.2M NaOH/1%SDS 破细胞的主要是碱，而不是SDS，所以才叫碱法抽提。溶液III 3M 醋酸钾/2M 醋酸 这一步的K置换了SDS（十二烷基磺酸钠）中的Na，得到PDS（十二烷基磺酸钾）沉淀；SDS易与蛋白质结合，平均两个氨基酸上结合一个SDS分子，钾钠离子置换所产生的大量沉淀自然就将绝大部分蛋白质也沉淀了，同时基因组DNA也被PDS共沉淀,质粒DNA煮沸法,煮沸法原理,染色体DNA比质粒DNA分子大得多，且染色体DNA为线状分子，而质粒DNA为共价闭合环状分子；当加热处理DNA溶液时，线状染色体DNA容易发生变性，共价闭环的质粒DNA在冷却时即恢复其天然构象；变性染色体DNA片段与变性蛋白质和细胞碎片结合形成沉淀，而复性的超螺旋质粒DNA分子则以溶解状态存在液相中，从而可通过离心将两者分开。,细胞器DNA差速离心法,差速离心法原理,是利用物质比重的不同分离混合物的一种方法。将待分离物质置于均匀介质（蔗糖）中，以一定的转速进行离心，比重大的物质优先沉降，比重小的却处于上层，从而得以分离。,线粒体和叶绿体是生物体内半自主性细胞器，自身可编码蛋白，它们的比重和大小一定，因而在同一离心场内的沉降速度也一定，根据这一原理，常用不同转速的离心法，将细胞内各种组分分级分离出来。,第一部分：DNA提取方法简介,第二部分：DNA提取常见问题、原因分析及其对策,内容,第三部分：RNA提取方法简介,第四部分：RNA提取及其RT-PCR常见 问题、原因分析及其对策,第二部分：DNA提取常见问题、原因分析及其对策,DNA提取的基本步骤,I.材料准备II.破碎细胞或包膜内容物释放III.核酸分离、纯化IV.沉淀或吸附核酸，并去除杂质V.核酸溶解在适量缓冲液或水中,材料准备,最好使用新鲜材料，低温保存的样品材料不要反复冻融提取血液基因组DNA时，要选择有核细胞（白细胞）组培细胞培养时间不能过长，否则会造成DNA降解含病毒的液体材料DNA含量较少，提取前先富集,基因组DNA的提取,质粒DNA的提取,使用处于对数期的新鲜菌体（老化菌体导致开环质粒增加）培养时应加入筛选压力，否则菌体易污染，质粒易丢失尽量选择高拷贝的质粒，如为低拷贝或大质粒，则应加大菌体用量菌株不要频繁转接（质粒丢失）,严谨性质粒和松弛性质粒,按照复制性质，可以把质粒分为两类：一类是严紧型质粒，当细胞染色体复制一次时，质粒也复制一次，每个细胞内只有12个质粒；另一类是松弛型质粒，当染色体复制停止后仍然能继续复制，每一个细胞内一般有20个左右质粒。一般分子量较大的质粒属严紧型。分子量较小的质粒属松弛型。质粒的复制有时和它们的宿主细胞有关，某些质粒在大肠杆菌内的复制属严紧型，而在变形杆菌内则属松弛型。,细胞裂解,材料应适量，过多会影响裂解，导致DNA量少，纯度低针对不同材料，选择适当的裂解预处理方式：植物材料液氮研磨动物组织匀浆或液氮研磨组培细胞蛋白酶K细菌溶菌酶破壁酵母破壁酶或玻璃珠高温温浴时，定时轻柔振荡,基因组DNA的提取,质粒DNA的提取,菌体量适当培养基去除干净，同时保证菌体在悬浮液中充分悬浮变性的时间不要过长（5分钟），否则质粒易被打断复性时间也不宜过长，否则会有基因组DNA的污染G菌、酵母质粒的提取，应先用酶法或机械法处理，以破壁,核酸分离、纯化,采用吸附材料吸附的方式分离DNA时，应提供相应的缓冲体系采用有机（酚/氯仿）抽提时应充分混匀，但动作要轻柔离心分离两相时，应保证一定的转速和时间（猕猴桃大提，10000转20min）针对不同材料的特点，在提取过程中辅以相应的去杂质的方法,基因组DNA的提取,质粒DNA的提取,核酸分离、纯化,蛋白质的去除：酚/氯仿抽提使用变性剂变性（SDS、异硫氰酸胍等）高盐洗涤蛋白酶处理,多糖的去除：高盐法：用乙醇沉淀时，在待沉淀溶液中加入1/2体积的5M NaCl，高盐可溶解多糖。用多糖水解酶将多糖降解。在提取缓冲液中加一定量的氯苯(1/2体积)，氯苯可以与多糖的羟基作用，从而去除多糖。用PEG8000代替乙醇沉淀DNA：在500L DNA液中加入200l 20%PEG8000(含1.2 M NaCl)，冰浴20min。,核酸分离、纯化,多酚的去除：在抽提液中加入防止酚类氧化的试剂：-巯基乙醇、抗坏血酸、半胱氨酸、二硫苏糖醇等加入易与酚类结合的试剂：如PVP、PEG(聚乙二醇)，它们与酚类有较强的亲和力，可防止酚类与DNA的结合,核酸分离、纯化,盐离子的去除：70的乙醇洗涤,核酸沉淀、溶解,当沉淀时间有限时，用预冷的乙醇或异丙醇沉淀，沉淀会更充分沉淀时加入1/10体积的NaAc（pH5.2，3M），有利于充分沉淀沉淀后应用70的乙醇洗涤，以除去盐离子等晾干DNA，让乙醇充分挥发（不要过分干燥）若长期储存建议使用TE缓冲液溶解TE中的EDTA能螯和Mg2+或Mn2+离子，抑制DNasepH值为8.0，可防止DNA发生酸解,基因组DNA的提取,质粒DNA的提取,DNA中含有蛋白、多糖、多酚类杂质DNA在溶解前，有酒精残留，酒精抑制后续酶解反应DNA中残留有金属离子,重新纯化DNA，去除蛋白、多糖、多酚等杂质（具体方法见前）重新沉淀DNA，让酒精充分挥发增加70乙醇洗涤的次数（2-3次）,DNA提取常见问题,问题一：DNA样品不纯，抑制后续酶解和PCR反应。,原因,对策,材料不新鲜或反复冻融未很好抑制内源核酸酶的活性提取过程操作过于剧烈，DNA被机械打断外源核酸酶污染反复冻融,尽量取新鲜材料，低温保存材料避免反复冻融液氮研磨或匀浆组织后，应在解冻前加入裂解缓冲液在提取内源核酸酶含量丰富的材料的DNA时，可增加裂解液中螯合剂的含量细胞裂解后的后续操作应尽量轻柔所有试剂用无菌水配制，耗材经高温灭菌将DNA分装保存于缓冲液中，避免反复冻融,DNA提取常见问题,问题二：DNA降解。,对策,原因,实验材料不佳或量少破壁或裂解不充分沉淀不完全洗涤时DNA丢失,尽量选用新鲜（幼嫩）的材料动植物要匀浆研磨充分；G菌、酵母裂解前先用生物酶或机械方式破壁高温裂解时，时间适当延长（对于动物细胞、细菌可增加PK的用量）低温沉淀，延长沉淀时间加辅助物，促进沉淀洗涤时，最好用枪头将洗涤液吸出，勿倾倒,DNA提取常见问题,问题三：DNA提取量少。,对策,原因,猕猴桃DNA提取实例,1.CTAB配方如上,配制好备用,65度水浴预热。猕猴桃叶片或果实采取后最好立即放到液氮中,避免酚类物质氧化 2.65水浴一个小时 3.氯仿：乙醇：异戊醇=80:16:4的抽提液 两次。10000转/分离心20分钟，尽量把丝状物压紧，避免吸取上清时有丝状物牵拉 等体积预冷的异丙醇，75%乙醇洗去其他杂质。洗两次。用无水乙醇5毫升洗一次。晾干5分钟挥发掉乙醇后加入3-5mlTE溶解，加入5ul,1mg/ml的RNA酶后保存,猕猴桃基因组DNA,第一部分：DNA提取方法简介,第二部分：DNA提取常见问题、原因分析及其对策,内容,第三部分：RNA提取方法简介,第四部分：RNA提取及其RT-PCR常见 问题、原因分析及其对策,第三部分：RNA提取方法简介,RNA提取的通用方法,异硫氰酸胍/苯酚法,原理：细胞在变性剂异硫氰酸胍的作用下被裂解，同时核蛋白体上的蛋白变性，核酸释放；释放出来的DNA和RNA由于在特定pH下溶解度的不同而分别位于整个体系中的中间相和水相，从而得以分离；有机溶剂抽提，沉淀，得到纯净RNA。,RNA提取的通用方法,异硫氰酸胍/苯酚法,步骤:材料准备：尽量新鲜。裂解变性：异硫氰酸胍（亚硫氢胍，巯基乙醇，N-月桂肌氨酸等）。使细胞及核蛋白复合物变性，释放RNA，有效抑制核酸酶。纯化分离：苯酚，氯仿，异戊醇。苯酚/氯仿可抽提去除杂物。洗涤：70乙醇。沉淀：异丙醇、无水乙醇。乙酸钠（pH4.0）：维持变性的细胞裂解液的pH值，沉淀RNA。此外还常用氯化锂选择沉淀RNA。,RNA提取的通用方法,影响RNA提取的因素,材料：新鲜，切忌使用反复冻融的材料如若材料来源困难，且实验需要一定的时间间隔。可以先将材料贮存在TRIzol或样品贮存液中，于70或20保存如要多次提取，请分成多份保存液氮长期保存，70短期保存,影响RNA提取的因素,影响RNA提取的因素,样品破碎及裂解：根据不同材料选择不同的处理方法：培养细胞：通常可直接加裂解液裂解酵母和细菌：一般TRIzol可直接裂解，对于一些特殊的材料可先用酶或者机械方法破壁动植物组织：先液氮研磨和匀浆，后加裂解液裂解。期间动作快速，样品保持冷冻样品量适当，保证充分裂解为减少DNA污染，可适当加大裂解液的用量,影响RNA提取的因素,纯化：在使用氯仿抽提纯化时，一定要充分混匀，且动作快速；经典的纯化方法，如 LiCl 沉淀等，虽然经济，但操作时间长，易造成 RNA 降解；柱离心式纯化方法：抽提速度快，能有效去除影响 RNA 后续酶反应的杂质，是目前较为理想的选择。,影响RNA提取的因素,第一部分：DNA提取方法简介,第二部分：DNA提取常见问题、原因分析及其对策,内容,第三部分：RNA提取方法简介,第四部分：RNA提取及其RT-PCR常见 问题、原因分析及其对策,第四部分：RNA提取及其RT-PCR常见 问题、原因分析及其对策,RNA提取常见问题,RNA 的降解 OD260/OD280 比值偏低 电泳带型异常 下游实验效果不佳,RNA降解,新鲜细胞或组织：裂解液的质量外源RNase的污染裂解液的用量不足组织裂解不充分另外某些富含内源酶的样品(如脾脏，胸腺等)，很难避免 RNA 的降解。建议在液氮条件下将组织碾碎，并且匀浆时使用更多裂解液。,RNA降解,冷冻样品：样品取材后应立即置于液氮中速冻，然后可以移至-70冰箱保存。样品要相对小一点；先用液氮研磨，再加裂解液匀浆；样品与裂解液充分接触前避免融化，研磨用具必须预冷，碾磨过程中及时补充液氮。,OD260/OD280 比值偏低,蛋白质污染：不要吸入中间层及有机相，加入氯仿后首先混匀，并且离心分层的离心力和时间要足够。减少起始样品量，确保裂解完全、彻底解决办法:重新抽提一次，再沉淀，溶解。苯酚残留：不要吸入中间层及有机相，加入氯仿后首先混匀，并且离心分层的离心力和时间要足够。解决办法:重新抽提一次，再沉淀，溶解。,OD260/OD280 比值偏低,抽提试剂残留：确保洗涤时要彻底悬浮 RNA，并且彻底去掉 75%乙醇。解决办法:再沉淀一次后，溶解。设备限制：测定OD260 及OD280 数值时，要使OD260 读数在 0.10-0.50 之间。此范围线性最好。用水稀释样品：测 OD 时，对照及样品稀释液请使用 10 mM Tris，pH 7.5。用水作为稀释液将导致比值的降低。,电泳带型异常,非变性电泳：上样量超过 3ug，电压超过 6V/cm，电泳缓冲液陈旧，均可能导致 28S 和 18S 条带分不开。变性电泳条带变淡：EB 与单链的结合能力要差一些，故同样的上样量，变性电泳比非变性电泳要淡一些；甲醛的质量不高。,下游实验效果不佳,RNA 降解 抽提试剂的残留 75%乙醇洗涤 样品中杂质的残留 多糖等杂质，再次沉淀 DNA 污染 使用RNase-Free 的 DNase I 消化抽提RNA,RT常见问题分析和解决方案,问题一：少量或没有RT-PCR产物,可能原因,解决方案,RT常见问题分析和解决方案,问题二：有非特异性带,引物和模板的非特异性退火 基因特异性引物设计较差 RNA中有基因组DNA的污染 形成引物二聚体 镁离子浓度太高,提高反应的温度和特异性 提高引物的特异性 使用扩增级DNase处理RNA 设计在3端没有互补序列的引物 优化镁离子浓度,可能原因,解决方案,RT常见问题分析和解决方案,问题三：产生弥散（smear）条带,第一链产物的含量过高 PCR反应中引物过多 循环数过多 退火温度过低 寡核苷酸片段产生的非特异性扩增,常规PCR步骤中减少第一链产物的量减少引物的用量 减少PCR的循环次数 提高退火温度 提取高质量RNA，防止被DNA污染,可能原因,解决方案,谢谢！,北京天为时代科技有限公司,本公司产品江苏地区特约代理商南京天为生物科技有限公司联系电话：025-86073713 84705301 8470150124小时订货热线：联系人：王彤免费技术支持：800 810 2177,