DNA分子标记的种类.ppt

DNA分子标记的种类以及进展,分子标记的定义,广义的分子标记(molecular marker)是指可遗传的并可检测的DNA序列或蛋白质。狭义的分子标记概念只是指DNA标记，而这个界定现在被广泛采纳。,理想分子标记的界定,(1)具有高的多态性(2)共显性遗传，即利用分子标记可鉴别二倍体中杂台和纯台基因型(3)能明确辨别等位基因；(4)遍布整个基因组；(5)除特殊位点的标记外，要求分子标记均匀分布于整个基因组；(6)选择中性(即无基因多效性)；(7)检测手段简单、快速(如实验程序易自动化)；(8)开发成本和使用成本尽量低廉；(9)在实验室内和实验空间重复性好(便于数据交换)。,但是，目前发现的任何一种分子标记均不能满足以上所有要求,DNA分子标记分类,一、第一代分子标记技术 以southern杂交为核心的分子标记技术：RELP标记等二、第二代分子标记技术 基于PCR的DNA分子标记：RAPD标记、ISSR标记、SSR标记、STS标记等 基于PCR与限制性酶切技术结合的DNA标记：AFLP标记、CAPS标记等三、第三代分子标记技术 基于单核苷酸多态性的DNA分子标记:SNP标记四、其他几种新型分子标记,一、第一代分子标记技术,限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism，缩写RFLP)是发展最早的分子标记技术。RFLP技术的原理是检测DNA 在限制性内切酶酶切后形成的特定DNA片段的大小。因此凡是可以引起酶切位点变异的突变如点突变(新产生和去除酶切位点)和一段DNA的重新组织(如插人和缺失造成酶切位点问的长度发生变化)等均可导致RFLP的产生。,流程图,酶切电泳标记探针杂交分析,一般选择单拷贝探针,如果RFLP探针是来自拷贝数可变串联重复(Varible number of tandem repeats，缩VNTR)则产生另一类因相同或相近序列的拷贝数变化所起的多态性。凡是引起复单位的大小和序列不同、基因组中重复的数目和分布不同等均可导致这种多态性的产生。在RFLP技术中成为分子标记的重复序列包括：(1)小卫星(minisatellite)序列：重复单位(motif)约有碱基l060个(也有16100个碱基一说)，在基因组中多次出现。(2)微卫星(microsatelite)或简单重复序列(simple sepuencerepeats，缩写SSR)：重复单位含有15碱基(也有28个碱基一说),二、第二代分子标记技术,1、基于PCR的DNA分子标记 随机引物PCR标记：RAPD标记、ISSR标、AP-PCR、DAF等 特异引物PCR标记:SSR标记、STS标记、SCAR、SPAR、SSCAP、ddF等2、基于PCR与限制性酶切技术结合的DNA标记 限制性酶切片段的选择性扩增来显示片段的多态性：AFLP标记等 对PCR扩增片段的限制性酶切来揭示扩增区段的多态性：CAPS标记等,随机扩增多态性DNA(RAPD),该技术用一个(有时用两个)随机引物(一般810个碱基)非定点地扩增DNA片段，然后用凝胶电泳分开扩增片段。不需要DNA探针，用一个引物可扩增多个片段，技术简单，只需少量的DNA样本，成本较低，RAPD标记一般是显性遗传（极少数是共显性），但是RAPD分析中重复性不高，由于共迁移的存在，在不同个体中出现相同分子量的滞后，并不能保证这些个体拥有同一条(同源）的片段,实验步骤,PCR电泳分析,应用,RAPD可用于对整个基因组DNA进行多态性检测，也可用于构建基因组指纹图谱。1、品种鉴定、系谱分析：用于识别种群、家族、种内或种间的遗传变异，为生物血缘关系或分类提供依据，还可以分析混合基因组样品等。2、基因定位：例如定位了莴苣霜霉病抗性基因。,RAPD技术的发展和相近的分子标记种类,DAF(DNA amplification fingerprinting）：与RAPD技术不同的是，在DAF分析中，引物浓度更高，引物长度更短（一般58个碱基）只有两个温度循环，并且往往用聚丙烯酰胺凝胶电泳，DAF通常会产生非常复杂的带型。在DAF技术的基础上，又展出ASAP技术。AP PCR(arbitrarily primed poymerase chain reaclion)：在APPCR分析中，扩增分为三个部分，每个部分要求的条件和组分的浓度存在差异；在第一个PCR循环中，引物浓度较高；引物长度不定，并且常常来自为其它目的而设计的引物MAAP(Multiple Arbitrary Punplicon Profiling)：这是CaetanoAnolle（1994）创造的一个词，想用来统称所有这些相关技术，但迄今为止这个词很少使用,加锚微卫星寡核苷酸(Anchored micmsatellite oligonucleotides）,Zietkiewicz et a1(1994)对STMS技术进行了发展，他们用加锚微卫星寡核苷酸作引物，对基因组节段而不是重复序列本身进行扩增。在SSR的5 端或3 端加上24个随机选择的核苷酸，这可引起特点位点退火。这样就能导致位于反向排列的间隔不太大的重复序列间的基因组节段进行PCR扩增。这类标记又被称为ISSR、ASSR或AMP-PCR。,任意引物PCR(Arbitrarily Primed Polymerase Chain Reaction，APPCR）,在APPCR分析中，所使用的引物较长（1050 bp)，PCR反应分为两个阶段，首先寡核苷酸引物在低严谨条件下与模板DNA退火，此时发生了一些合成，以便稳定模板与引物之间相互作用。然后进行高严谨退火条件的循环，两个位点间那些序列在低严谨度退火条件下发生的引物延伸可继续在高严谨条件下扩增。采用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析PCR产物，最终反应结果与RAPD类似。只要设计的引物在低严谨退火条件下能减少引物产生人为产物，应用成对组合的引物可以产生新的APPC R谱带，,但引物配对组合使用时，得到的图谱与单引物单独使用时产生的图谱之和很不相同，这样，50个引物能产生1250种不同指纹图谱。APPCR方法不需预知序列资料，而且检测的基因组样本是任意的，还能够用于检测近等基因系（或同类系）中的多态性。AP-PCR的缺点是每个新的多态性都必须经纯化才能进一步使用。另外，此方法在杂合体中仅可辨别长度多态性。,1.1.4 DNA扩增指纹印迹(DNA Amplification Fingerprinting，DAF),DAF是一种改进的RAPD分析技术，与RAPD技术不同的是，DAF分析中所使用的引物浓度更高，长度更短（一般为5一8 bp），因此它所提供的谱带信息比RAPD大得多，如当使用5个核苷酸的引物时，引物和模板的组合大约可扩增出10一100个DNA片段。PCR扩增产物是在凝胶上进行分离，通过银染即可产生非常复杂带型。,1.2.1 SSR（Simple sequence Repeats,简单重复序列）,SSR 分子标记由Lit t M,等于1989 年创建的。简单重复序（SSR）也称微卫星DNA，其串联重复的核心序列为1一6 bp，其中最常见是双核苷酸重复，即（CA)n和（TG)n每个微卫星DNA的核心序列结构相同，重复单位数目10一60个，其高度多态性主要来源于串联数目的不同。SSR标记的基本原理：根据微卫星序列两端互补序列设计引物，通过PCR反应扩增微卫星片段，由于核心序列串联重复数目不同，因而能够用PCR的方法扩增出不同长度的PCR产物，将扩增产物进行凝胶电泳，根据分离片段的大小决定基因型并计算等位基因频率。,SSR具有以下一些优点：（l）一般检测到的是一个单一的多等位基因位点；微卫星呈共显性遗传，故可鉴别杂合子和纯合子；所需DNA量少。显然，在采用SSR技术分析微卫星DNA多态性时必须知道重复序列两端的DNA序列的信息。如不能直接从DNA数据库查寻则首先必须对其进行测序。,特定序列位点（STS）,特定序列位点(sequence tagged site，缩写STS)是对由其特定引物序列所界定的一类标记的统称。利用特异PCR技术的最大优点是它产生的信息非常可靠，而不象RAPD、AFLP和利用随机探针产生的RFLP存在某种模糊性(如难以鉴别片段的来源)这类分子标记主要包括以下几种分子标记。,STMS,STMS(Sequence tagged microsateUites)通常又称为SSR，也可称为SSRP(Simple Sequence Repeat Polymorphisrms）。引物根据与微卫星重复序列两翼的特定短序列设计，用来扩增重复序列本身。由于重复的长度变化极大，所以这是检测多态性的一种有效方法。其特点包括：一般检测到的是一个单一的多等位基因位点；共显性遗传，故可鉴别杂合子和纯合子；得到的结果复性很高,STMS的发展和相近的分子标记种类,(1)把与SSR互补的寡核苷酸作为多位点RFLP技术中的探针；(2)把与SSR互朴的寡核苷酸作为PCR引物(可单独作引物或与随机引物配合使用)，扩增的是基因组DNA 的特定片段，即MP PCR和RAMPs：(3)用标记的SSR探针与RAPD扩增片段杂交即RAMPO或称为RAHM 或RAMS；(4)用5 或3 端加锚的SSR 作引物(如GGCA)，即ISSR。,DAMD(directed amplification of minisatellite region DNA),直接用小卫星的核心序列作引物进行扩增。,ISTR(inverse sequencetagged repeat,这种技术与SPAR 技术也相近，也所用的引物是在copia序列反向重复序列的基础上设计的，扩增的是copia序列之间的DNA序列。,IFLP(intron fragmemt length polymorphism),检测的对象是内含子的长度差异。,RAMPO(random amplified microsatellitepolymorphism),RAMPO的基本步骤是：先用一个单一的随机引物(即RAPD引物)对基因组DNA扩增，用电泳将扩增片段分开，然后，把凝胶转移到尼龙膜上，使之与一个带有放射性标记(或其它标记)的与SSR互补的寡核苷酸探针(如CA8和GA8)杂交，放射自显影后可得到新的多态性类。,1.2.3 序列特异性扩增区(Sequencecharacterized amplified regions SCAR),SCAR 标记是在RAPD技术的基础上发展起来的。其基本步骤是：先作RAPD分析，然后把目标RAP D片段(如与某目的基因连锁的R 片段)进行克隆和测序，根据原RAPD片段两末端的序列设计特定引物(一般比RAPD 引物长，通常24个碱基)，再进行PCR特异扩增，这样就可把与原RAPD片段相对应的单一位点鉴定出来。这样的位点就称为SCAR。SCAR比RAPD和其它利用随机引物的方法在基因定位和作图中的应用更好，因为它有更高的可重复性(原因是使用的引物长)，标记是共显性遗传的。SCAR标记方便、快捷、可靠，可以快速检测大量个体，结果稳定性好，重现性高。,1.2.4 单引物扩增反应(single primer amplification reaction SPAR),SPAR技术与RAPD技术相似的是也只用一个引物，但SPAR分析中所用的引物不是随机的，而是在SSR的基础上设计的，例如可能的序列是(TA)10或(CGA)6。扩增的是SSR之间的DNA序列。又称为MPPCR(microsatelliteprimed PCR)。分析其多态性。另外，还有一种与SPAR技术非常相似的标记技术，即ISTR(Inverse Sequencetagged Repeat）技术，ISTR所用的引物是在反向重复序列基础上设计的，PCR扩增的是反向重复序列之间的DNA序列。,1.2.5 DNA单链构象多态性(Single Strand Conformation Polymorphism，SSCP),SSCP是指等长的单链DNA因核昔酸序列的差异而产生构象变异，在非变性聚丙烯酞胺中的表现为电泳迁移率的差别。单链DNA构象分析对DNA序列的改变非常敏感，常常一个碱基差别都能显示出来。在SSCP分析中，利用PCR技术定点扩增基因组DNA中某一目的片段，将扩增产物进行变性处理，双链DNA分开成单链，再用非变性聚丙烯酞胺凝胶电泳分离，根据条带位置变化来判断目的片段中是否存在突变。SSCP结果判定是通过多个样品之间对比，观察条带之间位置改变，从而显示出不同生物个体的DNA特异性，,达到指纹分析目的。为了进一步提高SSCP的检出率，可将SSCP分析与其它突变检测方法相结合。其中与杂交双链分析（Heterocluplex analysis，Het）法结合可以大大提高检出率。Het法是用探针与要检测的单链DNA或RNA进行杂交，含有一对碱基对错配的杂交链可以和完全互补的杂交链在非变性PAG凝胶上通过电泳被分离开。对同一靶序列分别进行SSCP和Het分析可以使点突变的检出率接100%，而且实验简便。,应用,SSCP是基因突变检测的常用方法，广泛用于各类群体点突变的检测,包括人类遗传病基因突变的探测、癌基因或抑癌基因的突变探测等。在动物中,该技术也已应用于小鼠、牛、猪等的多种基因的检测。1、SSCP可用于预筛选克隆文库。2、采用SSCP分析技术对人体内病毒作整体性的研究。3、临床疾病基因突变分析检测脊髓性肌萎缩症基因缺失 4、分析检测细菌耐药性结核分枝杆菌 BFP药物敏感性。,双脱氧化指纹法(Dideoxy Fingerprints，ddF),ddF是将双脱氧末端终止测序法与SSCP结合起来的分析技术，对由双脱氧末端终止的长短不一的单链DNA进行SSCP分析。如果目的片段存在一个突变，则所有大于某一大小对应于突主变位置的双脱氧终止片段无野生型系统，对于每一个突有多次机会检测其迁移率改变，提高了检测突变的效率。ddF方法克服了SSCP分析时因DNA长度影响SSCP显示的困难，通过一种双脱氧核昔酸生产特异性的单链DNA，使其中长度合适的DNA片段显示SSCP改变。,2.1扩增片段长度多态性(AFLP),AFLP：特点是把RFI 和PCR结合了起来。其基本步骤是：把DNA进行限制性内切酶酶切，然后选择特定的片段进行PCR 扩增(在所有的限制性片段两端加上带有特定序列的“接头”，用与接头互补的但3 端有几个随机选择的核苷酸的引物进行特异PCR扩增，只有那些与3 端严格配对的片段才能得到扩增)，再在有高分辨力的测序胶上分开这些扩增产物，用放射性法、荧光法或银染染色法均可检测之。这种技术又称为“选择性限制性片段扩增。,应用,AFLP广泛用于构建遗传连锁图谱、基因组研究、遗传育种、亲子鉴定、遗传病诊断等领域。AFLP 产生的多态性远远超过 RFLP 和RAPD 等技术，因而被认为是指纹图谱技术中多态性最丰富的一项技术。但该技术已申请专利，在生产及商业上的应用受到一定的限制。,2.1 CAPS(Cleaved amplified polymorphic sequence),CAPS技术又可称为PCR-RFLP。所用的PCR引物是针对特定的位点而设计的。其基本步骤是：先进行PCR扩增，然后将PCR扩增产物用限制性内切酶酶切，再用琼脂糖凝胶电泳将DNA片段分开，用EB染色，观察。与RFLP 技术一样，CAPS技术检测的多态性其实是酶切片段大小的差异。在酶切前进行RCR产物检测，其多态性称为ALP。Neff et at，(1998)在此基础上又发展出dCARS技术(derived CAPS)，这是检测单核苷酸多态性的一种良好方法。,三、第三代分子标记技术：单核苷酸多态性(SNP)技术,单核苷酸多态性是指基因组DNA序列中由于单个核苷酸（A，G，C，T）的突变引起多态性，它是一种单核苷酸的变异。SNP是基因组中最简单、最常见的多态性形式，具有很高的遗传稳定性。随着计算机和DNA芯片技术引入分子生物学领域，研究者可同时对成千上万个克隆测序，用计算机分析数据和显示最终结果。常用方法：1、随即扩增DNA（RAPD）法；2、DNA芯片（DNA-chip）检测法,应用,遗传疾病研究基因连锁和关联分析药物基因组学药物发现/药靶农业/畜牧业遗传学法医/个体识别其它,四、其他几种分子杂交技术,1.MLPA标记2.RGAs标记3.SRAP标记4.TRAP标记,1.MLPA：多重连接探针扩增技术,多重连接探针扩增技术（multiplex ligation-dependent probe amplification,MLPA）是一种针对待检DNA序列进行定性和半定量分析的技术。该技术高效、特异，在一次反应中可以检测45个核苷酸序列拷贝数的改变，目前已经应用于多个领域、多种疾病的研究。,2.RGAs 标记(Resistance Gene Analogs,抗病基因类似物),RGAs 是用基于抗病基因保守序列设计的引物扩增基因组得到的抗病基因类似序列的新型的分子标记。尽管基因间整个序列的同源性不足于用RFL P 杂交检测,但抗病基因中存在的这些保守区域为在其它植物中进行PCR 扩增和分离RGAs 提供了机会。,3.SRAP(Sequence Related Amplified Polymorphism,相关序列扩增多态性),SRAP 标记是基于PCR 技术的新型分子标记技术,其原理是利用基因外显子里G、C 含量丰富,而启动子和内含子里A、T 含量丰富的特点设计两套引物,对开放阅读框架进行扩增。RAPD技术源于PCR技术，但又不同于PCR技术，差别主要体现在随机扩增引物上。首先，随机扩增引物是单个加入，而不是成对(正、反向引物)加入，其次，随机引物短，一般RAPD技术采用的引物含10个碱基，由于随机引物较短，与常PCR相比，RAPD退火温度较低，一般为3545。,SRAP的技术流程,1.引物的选择 大小：1718bp 上游引物：在5端前10个是填充序列，接着是CCGG，3端是3个选择碱基。下游引物:在5端前11个是填充序列，接着是AATT，3端是3个选择碱基。引物的设计原则：它们不能形成发夹结构或其他耳机结构 G、C含量在4050%上游和下游的填充序列长度在10或11个碱基，二者必须不同,2.DNA扩增 模板：基因组DNA或者cDNA 方法：复性变温法 扩增程序：,3.凝胶电泳以及扩增产物检测,4.TRAP 标记(Target Region Amplified Polymorphism,靶位区域扩增多态性),TRAP 是由HUJ G等于2003 年从SRAP 技术改进而来的新型分子标记技术,其原理是借助大规模测序技术产生的庞大生物序列信息,利用生物信息学工具和表达序列标签数据库信息设计引物,对目标候选基因序列区进行PCR 扩增产生多态性标记。此标记具有操作简单、重复性好、稳定性好、效率高的特点。目前已经成功应用于许多植物的遗传图谱构建、重要性状基因标记、种质资源的多样性研究及分子标记辅助育种等方面。,thank you!,