DNA与基因芯片.ppt

,第 二 十 一 章,基因诊断与基因治疗Genetic Diagnosis and Gene Therapy,南方医科大学基因工程研究所郭秋野,基因变异致病类型,内源基因的变异：基因结构突变基因表达异常,外源基因的入侵：,基因诊断和基因治疗,遗传性疾病,肿瘤、心脑血管病等,（生殖细胞）,（体细胞）,病毒感染性疾病：HIV、SARS、HCV、HPV,第 一 节 基 因 诊 断Genetic Diagnosis,特点：针对性强：病因学检测 特异性强：分子杂交技术灵敏度高：PCR、分子杂交放大效应，样品量少适应性强：内源、外源基因早期快速诊断：,一、基因诊断的概念和特点,定义：利用现代分子生物学和分子遗传学的技术和方法，直接检测基因结构及其表达水平是否正常，从而对疾病作出诊断的方法。,二、基因诊断常用技术方法,（一）核酸分子杂交技术,（二）聚合酶链反应(PCR)（三）基因测序（四）基因芯片,二、基因诊断常用技术方法,限制性内切酶谱分析法DNA限制性长度多态性(restriction fragment length polymorphism,RLFP)间接分析,（一）核酸分子杂交技术,核酸分子杂交技术原理：,核酸分子杂交的流程示意图,待测核酸制备,滤膜上核酸固化,杂 交,去除未参与杂交的探针,检 测 杂 交 信 号,制备探针核酸片段,探 针 标 记,加入标记核酸探针,Mst酶切位点(GCTNAGG),5,3,正常基因,突变基因,1.15kb,1.35kb,1.镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析,0.2kb,正常珠蛋白基因：5CCTGAGG3,镰刀型贫血：5CCTGTGG3,0.2kb,1.15kb,1.35kb,正常人,突变携带着,患者,1.镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析,DNA多态性：中性突变导致个体间核苷酸序列的差异限制性长度多态性分析：突变发生在酶切位点上，酶切DNA片段不同长度RFLP：孟德尔方式遗传，家族中，与某一疾病紧密连锁，作为遗传标志，判定家族成员是否携带致病基因应用：甲型血友病、囊性纤维病变、苯丙酮尿症,2.DNA限制性长度多态性分析,RLFP分析法,单基因病-苯丙酮尿症I 型,病因：肝脏合成的苯丙氨酸羟化酶（Phenylalanina Hydrozylase,PAH）缺乏。主征：智力低下，尿有霉味治疗：新生儿诊断明确后，即用低苯丙氨酸饮食控制血中苯丙氨酸浓度，改善脑子的发育，而“危险期”一过，病婴后来就基本正常。,PAH仅存在于肝脏细胞中，在绒毛、羊水细胞和胎儿血中均不表达，故不能通过测定酶活力及代谢产物来进行PKU的产前诊断只能依赖于家系分析，找出与PKU致病基因相连锁的RFLP，进行基因分析做出产前诊断,（二）聚合酶链反应（polymerase chain reaction PCR）,PCR定义：指由一对引物介导的基因或克隆的特定DNA序列的酶促扩增的反应过程，是DNA的体外扩增技术，本质是DNA的体外复制。应用PCR技术可以使特定的基因或DNA片段在短短的23小时扩增至百万倍。,（二）聚合酶链反应,Kary Mullis research scientist in the 1980s at a California biotechnology company called Cetus co-winner of 1993 Nobel Prize,PCR技术的基本原理,模板DNA的变性：94热变性，使DNA双链解离成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；模板DNA与引物的退火(复性)：55左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；引物的延伸：DNA模板-引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链,PCR产物以指数形式增加，即Y=2n(n 为循环次数),以爱滋病的临床检测为例，简要说明一下PCR在病毒感染的基因诊断中的应用。,组织中总RNA的提取 利用反转录酶合成cDNA PCR反应：反应缓冲液 模板（上述合成的cDNA）底物（dATP,dGTP,dCTP,dTTP）引物（爱滋病病毒特异性引物）TaqDNA聚合酶50l循环：95，30sec（变性）55，1min（退火）30循环 72，1min（延伸）,（三）基因测序技术,他们给DNA 的测序带来了一场革命，分享了1980年的诺贝尔化学奖。后来Sanger法发展为自动化测序法，并为人类基因组测序做出了卓越贡献。,Fred Sanger 发明的末端合成终止法(sanger法),Walter Gilbert发明的化学裂解法 Maxam-Gillbert法,末端合成终止法(sanger法)原理,2,3-双脱氧核苷三磷酸（ddNTP）与普通dNTP不同之处在于其脱氧核糖的3位置少一个羟基，可在DNA聚合酶作用下通过其5三磷酸基团掺入到正在增长的DNA链中，但ddNTP因缺乏3羟基而不能同后续的dNTP形成磷酸二酯键，因此，当正在增长的DNA链末端碱基为ddNTP时，则链延伸反应终止，不可能继续延伸。这样，在DNA合成反应混合物的4种普通dNTP中加入少量的一种ddNTP后，链延伸将与偶然发生却十分特异的链终止展开竞争，反应产物是一系列的核苷酸链，其长度取决于从用以起始DNA合成引物末端到出现过早链终止的位置之间的距离，结果将产生4类寡核苷酸，它们分别终止于模板链的每一个A、C、G或T的位置上。,双脱氧链终止法的测序基础是以双脱氧核苷三磷酸为循环测序反应的链终止剂。,P,OH,dNTP,ddNTP,P,OH,OH,P,P,P,P,OH,末端合成终止法(sanger法)原理,5,3,5,3,引物,模板DNA,dNTPDNA聚合酶,ddATP,ddTTP,ddGTP,ddCTP,末端合成终止法(sanger法)原理,末端合成终止法(sanger法)原理,DNA自动测序结果,（四）基因芯片技术,快速、高通量、平行化、自动化,指在固相支持物上原位合成寡核苷酸或者直接将大量基因探针以显微打印的方式有序地固化于支持物表面，然后与标记的样品杂交，通过对杂交信号的检测分析，得出样品的遗传信息（基因序列及表达的信息）,（四）基因芯片技术,1.芯片的制备,Gene probes（cDNA、DNA）,Ready-to-usemicroarray,or,arrayer,Sample cells,Extract RNA or DNA2)RT or PCR amplification3)Fluorescent labeling,Reference cells,Sample ready,combine,Labeled RNA or DNA(Sample),Labeled RNA or DNA(Reference),2),1),3),1),2),3),2.基因表达谱双色标记,3.分子杂交,1)hybridize,Apply sample,2)rinse,4.检测分析,Laser 1,Laser 2,Detector 1,Detector 2,芯片的扫描,5.图 像 处 理,Detector 1,Detector 2,False-color differential image,图 像 分 析,基因诊断方法,经典基因诊断.限制性内切酶法.RFLP分析法.寡核苷酸分析法,优点,缺点,.特异基因诊断.未知基因诊断.直接，过程简单,.过程繁杂.准确性低，过程繁.条件严格,基因诊断进展.PCR方法.PCR-序列分析法.DNA芯片技术,.简单、经济、敏感.操作直接、准确.集成度高、快速、并行,.假阳性高.价格高.尚无成熟产品问世,三、基因诊断的应用,遗传疾病肿瘤感染性疾病，传染性流行病判断个体疾病易感性器官移植组织配型法医学中个体识别、亲子鉴定,小结,基因诊断的定义基因诊断的特点基因诊断的常用技术,第 二 节 基 因 治 疗Gene Therapy,定义早期是指用正常的基因整合入细胞基因组，以校正和置换致病基因的一种治疗方法。,目前广义上来讲是指将某种遗传物质转移到患者细胞内，使其在体内发挥作用，以达到治疗疾病目的的方法。,一、基因治疗的概念,基因治疗的基本方法基因矫正(gene correction)基因置换(gene replacement)基因增补(gene augmentation)基因失活(gene inactivation),几种常见的基因失活技术,反义核酸技术核酶技术三链技术干扰RNA技术,基因治疗的其他方法：如“自杀基因”的应用，基因疫苗等,二、基因治疗的基本程序,治疗性基因的选择,基因载体的选择,靶细胞的选择,基因转移,外源基因表达的筛选 利用在体中的标记基因,回输体内,病毒载体非病毒载体,体细胞生殖细胞,间接体内疗法直接体内疗法,三、基因治疗的应用与展望,应用,展望,遗传性疾病、心血管疾病、肿瘤、感染性疾病、神经系统疾病,进一步寻找切实有效的基因精密调控外源基因在人体内的表达体细胞移植和重建的生物学研究减少外源基因对机体的不利影响,