首北方药学研究生论坛曾苏ADME在药物研发中的作用从成药性评价到新药转化研究.ppt

,曾苏 浙江大学药学院,ADME在药物研发中的作用-从成药性评价到新药转化研究,主要内容,新药转化研究的背景和成药性评价的意义基于细胞模型的药物吸收转运成药性评价基于药物代谢稳定性的成药性评价基于DMEs诱导和抑制的药物成药性评价基于药物代谢的毒性预测基于DMEs的新药设计,一.新药转化研究的背景和成药性评价的意义,新药研发是一复杂的庞大系统工程,所涉及的学科门类众多转化研究有助于构建创新药物的基础研究、临床前研究和临床疗效评价直至新药制造和临床应用的系统研发链顺畅基础医学和生物学与创新药物研发、临床医学之间的双向信息和研究关联缩短创新药物从实验室到临床应用的研发周期对于提高新药研发效率十分重要,药学学报，2011；46:19-29,USFDA,innovation/stagnation:challenge and opportunity on the critical path to new medical products，2004“关键路径行动计划”（The Critical Path Initiative）新药、生物制品和医疗器械研发、评价、生产和使用整个过程转化研究(translation research)的国家策略，以缩小大量生物医学和技术的发现与新药成功率之间的鸿沟,苏格兰卫生部与全球最大制药公司之一的惠氏制药公司合作,共同启动世界上第一个转化医学合作研究中心罗氏公司投资7100万美元，在新加坡设立转化医学研发中心 阿斯利康公司建立阿斯利康中国创新中心，并开展精神疾病基因及药物研发领域的转化医学研究,药物转化研究ADME评价贯穿始终,Hodgson J.ADMET-turning chemicals into drugs.Nature Biotechnol.2001;19:722-6.,DM/PK,Reasons for attrition(19912000).,先导物的优化是对分子的理化性质、药代和药效的综合修饰过分强调药效强度和选择性，追求高活性，而忽略理化和药代性质，会导致药物的效力低下往往也是体外有活性而体内无效的原因,成药性评价的意义,评价和预测基于药物代谢的潜在药物相互作用是新药研发中的重要环节，美国、欧洲、日本等国的新药注册审批部门对CYPs引起的药物相互作用都十分重视，发布了一系列研究指导原则1.美国FDA,Drug Metabolism/Drug Interaction Studies in the Drug Development Process:Studies In Vitro，1997；2.In Vivo Drug Metabolism/Drug Interaction Studies-Study Design,Data Analysis,and Recommendations for Dosing and Labeling，1999；3.日本，Methods of Drug Interaction Studies,2001,并不是所有的药物-药物相互作用都由CYPs引起，也可由UGTs或转运体引起，导致药物吸收、分布、代谢、排泄和毒性（ADME/T）性质改变,美国FDA在2006年指南中（Drug Interaction Studies Study Design,Data Analysis,and Implications for Dosing and Labeling），增加了转运体P-gp的研究内容2012年美国FDA指南中又新增UGTs和6种转运体BCRP,OATP1B3,OATP1B1,OCT2,OAT1,OAT3（Drug Interaction Studies Study Design,Data Analysis,Implications for Dosing,and Labeling Recommendations）欧洲EMA2010年指南中还列有胆酸盐外排泵(BSEP)和OCT1（Guideline on the Investigation of Drug Interactions）；转运体总数达到9种,CYPs,人源化转基因动物,摄入型转运体 将内外源性物质摄入细胞内，包括有机阴离子转运多肽家族（OATP）、有机阴离子转运体家族（OAT）、有机阳离子转运体家族（OCT）外排型转运体 多药耐药蛋白（MDR）、多药耐药相关蛋白（MRP）、乳腺癌耐药相关蛋白（BCRP）以及肝脏胆盐外排泵（BSEP）,二、基于细胞模型的药物吸收和转运成药性评价,Absorption Distribution Metabolism Excretion,红色标记的是美国FDA明确要求的转运体,1 2 3 4 MDCK Caco-2Western blot 检测四株MDCK/MDR1细胞P-gp的表达,Bcap37 1 2 3 4,Western blot 检测四株Bcap37/MDR1细胞P-gp的表达,药物吸收和转运细胞模型,Caco-2 cell,World J Gastroenterol.2004;10(9):1365-8.,鉴定P-gp底物或抑制剂的体外试验方法,1.抗病毒候选药物RDSS Caco-2细胞双向转运透过实验,该有效部位的透过系数很小，总透过率小于1%，并是外排泵P-gp的底物；再经过动物口服实验的验证，在各时间点未检测到有效部位化合物及代谢物。,加入P-糖蛋白抑制剂或底物后,在caco-2细胞单层的透过性增强。认为是P-糖蛋白的底物结论：该化合物难于制成常规口服制剂,J Pharm Pharmacol.2005;57:1297-303,2.Effects of inhibitors(100 mol/L)on the transport of Ast or Tax across Caco-2 cell monolayer,Papp非常相近，且均小于1 10-6 cm/s,落新妇苷和花旗松素分别为P-gp和MRP2的底物外排转运蛋白是限制其口服BA的主要因素之一(大鼠中的绝对生物利用度为0.066%和 0.17%),Int J Pharmaceut 2009;378:18,花旗松素和落新妇苷对P-gp具有诱导效应P-gp在蛋白表达及mRNA表达水平上均有上调增加R123在Caco-2细胞中的外排,Int J Pharmaceut 2009;378:18,LLC-PK1/BCRP细胞+抑制剂,LLC-PK1/BCRP细胞,转运实验:莲心碱外排作用强烈，在LLC-PK1/BCRP细胞上的净外排比为2.87加入BCRP的抑制剂CsA和GF120918后，净外排比显著降低至1左右,细胞摄取实验,3.CNS BBB,CNS BBB CD,poorly permeability:05;moderately permeability:01,02,03;well permeability:04,R02 and R05 may be the substrates of P-gp,底物 Substrate:Drug is metabolized by the enzyme system诱导剂 Inducer:Drug that will increase the activity or synthesis of CYP450 enzymes抑制剂 Inhibitor:Drug that will decrease the metabolism of a substrate,三、基于药物代谢稳定性的成药性评价,CYPs,UGTs,药物代谢酶,UGT1A1,1A3,1A4,1A6,1A9,2B7,2B15,in vitro studies can be conducted using recombinant human DMEs,P450,UGT,DM/PK对新药研发的意义,任何药物在体内都有其发挥疗效的有效期，因为大部分药物在体内都会被代谢而失去活性代谢可以使脂溶性药物转变为水溶性化合物，从而加速药物从体内的排泄,Drug,Metabolism,Drug,OH,Drug,OGlu,Conjugation,Excretion,指导结构修饰,若CYP酶代谢消除占药物总消除的 25%时，则必须鉴定哪种CYP酶参与代谢将药物和肝细胞或微粒体共孵育，然后分析孵育介质或细胞内容物（HPLC-UV、荧光或放射性检测，HPLC-MS/MS）。可对形成的代谢物直接鉴定,In Vitro Methods for Determination of Metabolic Stability,Phase I代谢,Phase I&II,同工酶,代谢物结构鉴定,细胞代谢,Isolated hepatocytes,models and techniques used to study DM In vitro,Enzyme:Isolated hepatocytes and precisioncut liver slices Subcelluar fractions(hepatic microsomes,S9,Cytosol)3.Human recombinant enzyme,Pure human enzyme,Inhibitor:1.Chemical inhibitors2.Antibody3.RNAi,Inducer:1.Chemical inducers2.Ligands of nuclear receptors,Anal technique:1.Sensitive and specific assays2.RT-PCR3.Western Blot4.Reporter gene assay,酶底物的鉴定方法:抑制剂探针法,General Method,Human tissues,Subcellular liver tissue fractions,New Drug,Metabolite,Chemical InhibitorAntibodyRNAiChemical Inducer,Identify DMEs Substrate,Isoform,Analytical Method,人重组药物代谢酶 确证,The effects of P450 specific chemical inhibitors on ECB oxidative metabolism in human liver microsomes,CYP3A,CYP1A2,3A4,CYP1A2,CYP2D6,CYP2E1,CYP2C9,CYP2C19,Zhang X,et al,Drug Metab Dispo,2010,HLM,(A)SCAN-ESI of HLM incubate(B)SIR-ESI(211)of HLM incubate(C)Negative-ion ESI-MS/MS spectrum of the deprotonated metabolite ions(211),Human recombinant CYP3A4,UGTs的抑制剂丙磺舒和丙戊酸(UGT通用抑制剂)胆红素,阿扎那韦(UGT1A1)槲皮素(UGT1A3)三氟拉嗪(UGT1A4)保泰松(UGT1A6)丙泊酚(UGT1A9)双氯酚酸钾(UGT2B7),UGT1A6/7,动物诱导,人,UGT1A3,UGT2B7,Biochem Pharmacol,73:1842-51(2007),特异性化合物作为酶抑制剂,“十一五”重大专项一类新药,动物生物利用度较低?,代谢稳定性差!,N-glucuronidation by UGT1A4,The imipramine incubated with the recombinant UGT1A4 and without(A)or with(B)UDPGA.Peaks1:imipramine;peak2:p-nitrophenol;peak3:imipramine N-glucuronide,Biochem Biophys Res Commu 2004;319:386-392,Propranolol side chain(-OH)glucurnidation,Chirality.2010；22:456-61.,The cumulative excretion percentage of S-(-)-and R-(+)-propranolol glucuronide in Chinese Han subjects urines after 20mg oral administration of RS-()-propranolol tablet(xs%,n=16),Primary Worries in Primary Care:1,008 Patients,Source:American Society of Health Systems Pharmacists.ASHP Patient Concerns National Survey Research Report,四、基于DMEs诱导和抑制的 药物成药性评价,VA Medical Center(in-and outpatients)(n=1076),0%,2%,4%,6%,8%,10%,12%,14%,Number of drugs prescribed,Percentage of patients,4 or more,drugs,68%,3 drugs,13%,2 drugs,12%,1 drug,7%,Shad MU,et al.Clin Pharmacol Ther.65:183,1999.Abstract PIII-25,若药物抑制CYP酶，则可能降低通过相同途径代谢的合用药物的清除率，可直接导致其血药浓度的升高，从而引起不良反应或使疗效增加代谢途径的抑制也可能导致合用（相同酶代谢）前体药物其活性代谢物的产率减少，从而降低疗效,CYP抑制剂,CYP3A4,Terfenadine(Seldane),Fexofenadine(Allegra),引起严重的心脏毒性,Preferred and acceptable chemical substrates for in vitro experiments,探针底物,CYP阳性对照抑制剂,探针底物,对CYP抑制程度的判断,临床发生DDI的可能性:,弱抑制中等抑制强抑制,不可能可能很可能,CYP抑制作用的评价,1。药酶动力学参数：Km、Vmax和 Clint 2。抑制常数或IC50,P450,LC/MS/MS分析方法的质谱条件,CYP诱导剂,药物若能诱导代谢酶，则可使经相同途径代谢的合用药物的代谢清除率增加,可导致血药浓度低于治疗浓度可使前药的活性代谢产物增加，从而引起不良反应,3A4,3A4,Drug D(inducer),Drug C,Induction of 3A4 lower concentration of Drug C,多数诱导剂是一些高脂溶性、长生物半衰期的化合物。典型的诱导剂有：诱导剂 被诱导的酶苯巴比妥(PB)2B,3A 亚族3-MC,-萘黄酮(-NF)1A亚族地塞米松(DEX)3A亚族乙醇，吡啶 2E亚族,（1）大鼠诱导,Chemical Inducers for In Vitro Experiments*,（2）肝细胞,（3）DME的诱导机制,荧光素酶报告基因法Luciferase reporter gene assay,利福平（阳性对照）验证报告基因法构建成功(PXR/CYP3A4)CAR/CYP3A4,GR/CYP3A4,1)CYP3A4诱导,PXR-+P3A4-+-+,中药提取物对CYP的转录激活作用的快速评价五味子、白术、枸杞根提取物对CYP3A4的转录激活能力高于利福平7种中药麦冬、当归、黄连、茵陈、银杏叶、生首乌、川芎提取物对CYP3A4的转录激活能力与利福平相当从丹参、当归、五味子、银杏叶中鉴定了5个新的PXR激动剂,CYP3A4(331bp)-actin(202bp),J Ethnopharmacol(2011),Induction of CYP3A4 mRNA,PXR/HepG2 cells,12种中药中，川芎、甘草、五味子对CYP3A4 mRNA的诱导作用最为明显与报告基因实验结果一致,2).CAR-CYP2B6报告基因分析,hCAR的经典配体CITCO（2 mol/L）,Initially,CYP1A2,CYP2B6,and CYP3A should be evaluated in vitro Drug is not an inducer of CYP3A4 then it can be concluded that the test drug is also not an inducer of CYP2C8,CYP2C9,or CYP2C19,成药性评价结果的判断:,评估,评估,评估,评估,评估,五、基于药物代谢的毒性预测,Prediction of ADRs or toxicity governed by drug metabolism,HMM,MDA,HMA,100倍T,HepG2 细胞经10M 利福平（CYP3A4，2C诱导剂）(A)25M-萘黄酮（CYP1A2诱导剂）(B)预处理后，用MTT法测定银杏酸GA（15:1）对细胞的毒性增加,Toxicology Letters,2009,187:131-136,肝细胞 诱导/抑制-MTT法,一些官能团如芳基胺、硝基苯环、噻吩、呋喃和3-甲基吲哚等往往被认为是危险结构，通常在设计候选药物时要避免,GA(15:1)GA(15:1)remained in culture medium,(mol/L)-naphthoflavone(mol/L)ketoconazole(mol/L)Control 0.5 5 15 0.5 5 15,20 6.70.6 7.80.71 8.30.6 9.40.7 7.30.7 7.70.6 8.60.8 40 13.90.7 15.90.8 17.00.8 19.30.9 14.70.8 15.40.7 16.90.7 60 22.20.8 22.80.9 25.91.0 31.51.0 22.70.9 24.51.0 27.60.9,-萘黄酮（CYP1A抑制剂）和酮康唑（CYP3A抑制剂）共孵育可降低银杏酸（15:1）对原代培养大鼠肝细胞的毒性 CYP1A和CYP3A催化银杏酸（15:1）生成毒性更强的代谢物,The shRNA plasmids inhibits CYP3A4 mRNA expression in HepG2 cells.(C)The shRNA expression plasmid inhibits CYP3A4 mRNA.(D)The shRNA did not change CYP3A5 mRNA expression normalized to corresponding GAPDH mRNA level,RNAi方法,转基因细胞方法,紫杉醇:CYP3A4&P-gp底物,针对先导化合物代谢过快或生成毒性代谢物的缺点，进行结构改造使新药候选物按照预定的代谢途径失活或不代谢而由原形排出体外，以获得安全稳定的候选物合成有效代谢物或模拟有效代谢物的结构以获得新的候选物根据候选药物的吸收代谢特性设计合理的药物剂型及其处方,六、基于DMEs的新药设计,Carrier-linked prodrugs,Activity,1、前药设计,Uptake and Efflux transporters in the small intestine play a significant role in determining oral drug bioavailability,pH=4-7,Lumen,Blood,P-gp,CNT,PepT1,OATP,MRP2,BCRP,ENT1,MRP3,OCT1?,2.转运前药设计,应用设计特定转运体的底物改进药物吸收提高生物利用度,加巴喷丁：用于治疗癫痫和带状疱疹后遗神经痛血液（和大脑）的水平与口服剂量不成正比，血液中Cmax有限，病人口服吸收存在高度变异性，半衰期短：5-7h，一天需要服用3-4次是一种定位于小肠低转运能力的氨基酸转运体底物,XP13512是加巴喷丁的转运前体药（Transported Prodrug），与P450或Pgp不发生相互作用，是两种在全肠道表达的转运体MCT-1和SMVT的底物在肠，肝和血被非特异性酯酶裂解生成加巴喷丁。在宽剂量范围内与加巴喷丁生物利用度（70%）成正比。与加巴喷丁比较，猴子口服后，血浆中加巴喷丁Cmax增加5倍，AUC增加3倍,加巴喷丁,XP13512,Saturable uptake exposure not proportional to dose Variable capacity/transit times-inter-subject variability in PK No colonic absorption-SR formulation not possible,Gabapentin Has a Limited GI Absorption Window,Transit Time in Humans,氨基酸转运体底物,Overcoming a Limited Absorption Window,Increased bioavailability Greater dose proportionality Lower inter-patient variability Reduced dosing frequency(sustained release),Modify the drug for recognition by high capacity transporters located throughout the intestine:,MCT-1和SMVT的底物,XP13512(IR)vs.Neurontin:Concentrations of Gabapentin in Blood,Effect of Dose on Concs.of Gabapentin in Blood After Oral Administr.of Neurontin or XP13512 to Healthy Adults,All AEs reported for XP13512 were mild and similar to those reported for Neurontin,XP13512:Dose Proportionality of AUC,Effect of Dose on AUC of Gabapentin in Blood AfterOral Administration of XP13512 or Neurontin,XP13512 produceddose-proportional exposure,Neurontin exposure showed saturation,R2=0.994,XP13512:High Bioavailability as Gabapentin,Effect of Dose on Bioavailability as GabapentinAfter Oral Administration of XP13512 or Neurontinto Healthy Volunteers,Neurontin absorptionwas saturated,No saturation of XP13512 absorption or conversion to gabapentin,XP13512:Very Low Exposure to Prodrug,Concs of Gabapentin and Intact XP13512 in Blood AfterOral Administ of XP13512 to Healthy Volunteers at 2800 mg,Gabapentin Cmax was 50-foldhigher than prodrug CmaxGabapentin AUC was 280-foldhigher than prodrug AUC,3.基于代谢物的新药发现和药物设计,研究药物在体内外的代谢物设计生物转化激活的前体药物发现一些活性代谢物比母体药物更安全有效或再经过结构修饰发现新药新药发现和药物设计的一种重要来源,Phenacetin,1887(nephrotoxic,methemoglobinemia),Recognized as active metabolite of phenacetin in 1948;popular in US since 1955,磺胺,还原,CYP3A4,Terfenadine(Seldane),Fexofenadine(Allegra),CYP3A4,2C19,Diazepam,Oxazepam,4.药物代谢性质用于制剂设计,抗哮喘药异丙肾上腺素在肠道和肝中代谢而迅速失活，口服给药方式无法使其有效到达作用部位肺组织采用喷雾剂吸入给药，这样可绕过使药物失活的代谢途径，以足够产生药理活性的浓度到达肺组织,硫酸化,葡萄糖醛酸化,氧化,肠道代谢在口服给药中也可作为有利的一面加以应用琥珀酰磺胺噻唑（succinylsulfathiazole）的肠吸收较差，但是易被肠道酶水解生成有活性的磺胺噻唑（sulfathiazole）这种局部水解作用可保证肠道中有效的抗菌浓度，有利于治疗肠道感染,酰胺酶,临床前药物代谢动力学技术平台 2009ZX09304-003中国人个体化用药相关重要生物标志物及其新型检测试剂盒研发关键技术(参加)2012ZX09506001-004,致谢：国家重大科技专项“重大新药创制”创新药物研究开发技术平台建设,Spring,Summer,Autumn,Winter,West lake,Hangzhou,浙江大学紫金港校区,Thank You for Your Attention！,UGTs的诱导剂-萘黄酮,3-MC,TCDD(UGT1A6/7)苯巴比妥,苯妥英(UGT1A1/9,2B7)地塞米松(大部分UGT1A 和 UGT2B)rifampicin(UGT1A),