ATERS液相色谱.ppt

液相色谱教程(三)液相色谱实验操作,Waters 中国有限公司培训中心,启动液相色谱仪器的流程,开启HPLC系统各个设备的电源打开泵、自动进样器、检测器电源，待设备通过自检后，打开计算机，启动色谱管理软件准备流动相过滤,脱气色谱泵排气用新配制的流动相灌注泵,启动液相色谱仪器的流程,用准备好的流动相平衡色谱系统可在泵的控制面板上设定流速参数(155泵需在软件控制下操作)系统大约需平衡0.5-1小时方能稳定工作准备样品用流动相溶样或重组样品编制仪器方法,开始实验,液相色谱对流动相的要求,色谱柱对流动相的要求过滤除去微粒纯度的要求超纯水，或用KMnO4处理过的双蒸水有机溶剂：色谱纯(溶剂中的杂质含量尽可能低)，并与填料相匹配缓冲液的pH值，在填料的允许范围(一般在pH2-8)内缓冲液（盐）的浓度不要太高(100mM)流动相对样品的溶解度调整有机溶剂和水的比例最好用流动相溶样,液相色谱对流动相的要求,液相色谱仪器对流动相的要求与检测器匹配脱气避免用含卤素离子的缓冲盐（不锈钢系统）溶剂的粘度防止细菌的生长,流动相的脱气,流动相脱气的目的使色谱泵的输液准确输液量均匀准确，并且脉动减小保留时间及色谱峰面积的重现性提高提高检测的性能防止气泡引起的尖峰基线稳定，信噪比增加溶剂的紫外吸收本底降低保护色谱柱减少死体积防止填料的氧化,流动相脱气的方法,加热简单，如同抽真空一起使用，其效果很好。但容易造成流动相组成的变化抽真空同上，一般在溶剂抽滤的同时，也有脱气的效果超声波振荡简单，但效果不够理想；超声时间不要太长(1分钟左右即可)通惰性气体（一般用氦气）可保持在线连续脱气，多用于低压梯度在线脱气机（in-line degasser)可保持连续脱气，多用于低压梯度,流动相的保存,有机溶剂流动相:室温下密封,避光保存缓冲盐流动相:当日现配现用低温下密封保存,一般不超过3天防止微生物生长有机溶剂与水（缓冲盐）混配的流动相:低温密封保存防止有机相的挥发选用适宜的容器,分,保存于聚乙烯瓶中的超纯水,测试条件水样:40ml trace enrichment 2.0 ml/min色谱柱:C18 反相柱(Waters)梯度:线性 100%水 100%乙腈波长:254 nm,保存于棕色玻璃瓶中的超纯水,测试条件水样:40ml trace enrichment 2.0 ml/min色谱柱:C18 反相柱(Waters)梯度:线性 100%水 100%乙腈波长:254 nm,色谱泵的排气操作,色谱泵实验前，应先确认泵头内没有气体，如有气体要按以下步骤排气：将泵入口管吸滤头放入脱过气的流动相中打开泵及在线脱气机电源开关将排液阀打开，或断开与色谱柱连接的管路设置流速到6-9ml/min,排液阀出口有液流连续流出必要时(600泵)用10ml注射器从泵入口注入流动相对于600,2695四元梯度泵,分别对所用各路溶剂进行排气操作 停止泵流速,关闭排液阀,恢复断开的管路,备用注:泵排气后,应输液稳定(系统压力脉动小,一般在几十 Psi以内),否则,需重做排气操作,Waters 515 泵的前面板,电源开关柱塞杆清洗孔排液阀,Waters 600泵的前面板,柱塞杆清洗孔,电源开关,排液阀,泵控制器,泵体,泵灌注阀,Waters 2695 分离单元,2695排气操作示意图,面板操作:打开状态(Statas)画面 按右下角Direct Function功能键选 Dry Pime或 Wet Prime命令选OK 即可进行泵的排气注:当流路中充满空气时,按图示做Dry Prime若只是更新流动相时,只须作Wet Prime,关于色谱系统的反压,什么是反压(back pressure)流动相流经管路及色谱柱时会有阻力,即所谓的反压,又称系统反压或系统压力Waters习惯用的压力单位是Psi(磅/平方英吋)其它单位有:Bar,Mpa影响系统反压的主要因素:流动相的溶剂组成温度流速,反压与溶剂组成的关系,流动相的粘度是产生反压的主要原因有机溶剂水的粘度随组成而改变其压力随组成变化如下图所示,反压与流速的关系,流速对反压的影响是线性关系流速增加，反压亦增大 下图的实验条件：2.130mm Symmetry C18柱,20,反压与温度的关系,温度对反压的影响是反比关系温度升高,反压降低,对某些流动相的影响更大一些,影响系统反压的其它因素,反压与色谱柱长度成正比反压与填料颗粒度的平方成反比2.5m填料比3.5m填料反压高反压与管路直径的四次方成反比(1/D4)反压与管路的长度成正比,色谱泵的运行,排气后的色谱泵即可用于实验运行注意排气后，先设流速为 0恢复排气时断开的部分，如:进样器、色谱柱如需要，恢复排气时断开的控制线根据色谱柱的不同，逐渐提高流速到设定值若使用缓冲盐流动相,用前和用后均需用水过渡(包括排气操作),色谱泵的维护保养,流动相要过滤常用缓冲液时，停泵前要用水清洗泵头，并用水冲洗柱塞杆清洗孔关闭排液阀时，不要太用力拧紧，以不渗液为准更换流动相时，要保证两种溶剂的互溶性,如不互溶，要用一种中间溶剂过渡色谱泵在停用时,应先用水洗去缓冲盐,然后用纯甲醇充满泵头及管路,并保存在纯甲醇中,液相色谱系统的清洗与钝化,色谱泵吸滤头,进出口阀及管路(包括进样器和检测池)若被污染,应作清洗和钝化处理一般采用30磷酸水溶液作为清洗剂，用6M硝酸作为钝化剂，先清洗再钝化清洗的目的是去除不锈钢管路及系统内的污垢钝化的目的是使不锈钢管路的内表面形成光滑均匀的氧化膜,色谱泵及系统的清洗,清洗液用30%磷酸水溶液30%磷酸配制:取85%浓磷酸35ml与65ml水混匀清洗步骤如下:取下色谱柱，用两通(Union)连接进样器和检测器用纯水灌注泵头(四元泵的A,B,C,D四路各为25%)用30%磷酸清洗液洗系统(1ml/min流速)45分钟(四元泵的A,B,C,D四路各为25%)换成清水洗至出口水pH显中性用纯甲醇过渡，浸润泵头及管路，备用,色谱泵及系统的钝化,钝化液用6M硝酸水溶液6M硝酸的配制:取浓硝酸40ml与60ml水混匀钝化步骤如下:在清洗步骤完成后进行钝化处理确认清洗用的磷酸已基本洗净用纯水灌注泵头(四元泵的A,B,C,D四路各为25%)用6M硝酸水溶液钝化系统(1ml/min流速)45分钟换成清水洗至出口水pH显中性用纯甲醇过渡，浸润泵头及管路，备用,实验样品的制备,标样和样品标样:又称对照品,它作为液相色谱定性和定量分析的参 考标准物,一般是纯度较高的纯物质样品:待测物,一般是成分复杂的混合物液相色谱对样品(包括标样)制备的要求:必须能溶于流动相如样品的溶剂不是流动相,一定要用流动相试溶解度,以免在进样时样品在流动相中析出,堵塞管路和色谱柱 样品溶液要过滤除去微粒及杂质了解样品对色谱柱的基质/填料是否有破坏作用,复杂样品的预处理,样品预处理的目的除去微粒减少干扰杂质浓缩微量的组份提高检测的灵敏度及选择性改善分离的效果有利于保护色谱柱及仪器,样品预处理的重要性,是影响实验成败的决定性步骤占样品分析时间的比例最大样品预处理所用时间远多于色谱分离的时间占分析消耗总成本的比重最大消耗大量的溶剂及其它化学品对分析结果的重现性及准确性影响最大的环节影响实验结果好坏的最重要因素,样品预处理常用的方法,高速离心取上清液过滤、超滤选择性沉淀衍生反应液-液萃取固相提取(Solid Phase Extract,SPE)Oasis和Sep-Pak固相提取小柱其它,去除微粒的方法,过滤过滤膜/过滤装置有机滤膜(0.5 m)/水溶性滤膜(0.45 m)膜片可更换一次性使用的膜“Cartridge”使用方便简单，交叉污染小有更小内径，可用于微量样品的处理高速离心大于：10,000rpm,超滤,机理超滤是一种基于分子量分离的技术目的根据分子量的不同把分子、细胞及病毒等分为不同的馏份除去小分子样品中的大分子蛋白脱盐,选择性沉淀,常用于生化样品中除蛋白有机溶剂乙腈，甲醇强酸三氯乙酸，高氯酸盐50%硫酸铵10%TCA(三氯乙酸钠),样品衍生,提高检测的灵敏度增加紫外基团以增强紫外检测的灵敏度增加荧光基团以便使用高灵敏度荧光检测器改变分离的选择性改变组份的基团，如：变离子型化合物为非离子型，用反相方法分离典型的例子柱前衍生氨基酸分析,AccQ-Tag 衍生法,浓缩样品,目的：富集微量或痕量组份浓缩样品的方法 萃取/吹干 沉淀/再溶解 色谱法 固相提取 Oasis小柱 Sep-Pak小柱,Oasis HLB固相提取小柱,亲水-亲脂平衡共聚物,“亲水”使填料具有水可浸润性质降低与水的接触角,“亲脂”提供对被分析物质的反相保留能力,这是适合于分析众多基质中大多数样品的通用操作步骤建议首先使用这种通用的操作步骤如果需要进一步降低干扰物的影响，可使用二维SPE方法注:此方法于规格为3cc,60mg的OasisHLB 小柱上开发,样品预处理的通用SPE方法,SPE处理的效果,进样器的使用,进样器的种类:手动进样器7725i自动进样器717Plus，2695样品管理系统进样器与系统的连接：进样器的入口与色谱泵的出口相连进样器的出口与色谱柱的入口相连要求：出入口方向不能接错，接头不能留有空隙进样器的连接管路：出口管路一定要用细管(内径0.009),长度要短,尽量减少谱带扩展,手动进样器的使用,7725i手动进样器的进样方式:固定体积进样:进样量取决于Loop的体积可变体积进样:进样量由微量注射器量取注意:固定体积进样需要用超过Loop体积5-10倍的样品量进样,以保证进样浓度不被稀释可变体积进样在注射器注入样品后,应尽快将进样器扳至Inject位置,以避免样品在Loop中的扩散进样器的清洗:每次进样前应将微量注射器清洗干净,防止样品间交叉污染,影响实验结果,自动进样器的使用,自动进样器(717Plus和2695样品管理系统):样品瓶位置和进样量由软件设定注意:样品瓶中应有超过13瓶高度的样品量使用内衬管(Insert)时应设定针高度为2mm(2695)或 75%高度(717Plus)进样器的清洗:进样针是流路的组成部分,运行中一直由流动相清洗进样针外部由软件控制在每次进样前用洗针液清洗若注射器内出现气泡，用面板操作的Purge Inject功能清除之,自动进样器的洗针液,注意洗针溶剂瓶(内放绿色塑料管)不要放在仪器的上部，应放于与仪器同一水平面的实验台上,洗针溶剂根据流动相的不同应有不同：,检测器的启动操作,连通流路：色谱柱出口接检测器入口注意接头不要留有空隙连接管路要用细管(0.009)检测器出口用适当的管路(内径,长度)通向废液瓶连通数据线路:IEEE 电缆(对大多数检测器)与软件busLAC/E卡连接手动进样器的启动信号线与检测器背板上的Inject Start 接口连接开启电源开关后,需待检测器通过自检后,才能被软件控制(约需5-10分钟)通流动相平衡至少30分钟后才能正常工作,Waters 2487 检测器,2487的显示屏幕,通道,吸光度,灯开/关,波长,灵敏度,下一画面,运行时间(分),自控/遥控,诊断开/关,键盘锁开/关,单/双波长,Shift 开/关,AUFS(Absorbance Unit Full Scale):满量程吸光度单位,2487的面板及操作,回车键,分屏显示键,选项移动键,主屏幕,方法调用，A/B通道切换,设置及诊断,单/双波长，自动调零,运行/停止键,第二功能键,监视色谱图,屏幕对比度,Waters 2996 PDA 检测器,PDA(PhotoDiode Array):光电二极管矩阵,由软件设定检测器参数,只需设定如下参数即可采集数据波长范围分辨率每秒采集的光谱数操作极为简便不需费神选择参比波长及其带宽,Waters 2414示差折光检测器,2414的显示屏幕,冲洗参比池,折射率,极性,RIU量程,检测器温度,下一画面,运行时间(分),自控/遥控,键盘锁开/关,模式,Shift,2414的面板及操作,回车键,屏幕对比度,选项移动键,主屏幕,方法调用，温度设置,自动调零,运行/停止键,第二功能键,监视色谱图,冲洗参比池,设置及诊断,下一页,2414检测器的日常操作,设定检测器内、外(如有柱温箱)温度以5ml/min的流速“purge”参比池五分钟不接色谱柱！参数设置按文献值或实验决定至少需要2小时以上的平衡时间通常检测器可以在白天结束工作后不关机，保持0.1到0.5ml/min的流速循环冲洗样品池和参比池,可节省第二天的平衡时间,使用示差检测器的注意事项,不能做梯度实验最大的池耐压是 100 psi注意保持出口管路的畅通流速范围是 0.1-10 ml/min 此种类型检测器是压力敏感和温度敏感型检测器注意保持泵压力的平稳注意环境温度的恒定,Waters 2475荧光检测器,2475 检测器的特点,可调波长荧光检测器双扫描在扫描模式下(Scan)发射波长及激发波长均可扫描高灵敏度水的RAMAN峰S/N大于200可编程 时间-波长 时间-增益由RS232串行口或网线与计算机相连,2475的主显示屏,发射/能量,灯开/关,下一页,运行时间(分),面板/软件控制,键盘锁/开,Shift开/关,单/多波长,通道选择,增益,波长,诊断键开/关,灵敏度,2475的面板及操作,回车键,分屏显示键,选项移动键,主屏幕,方法调用，通道切换,设置诊断,自动调零,运行/停止键,第二功能键,监视色谱图,开关灯,屏幕亮度调节,光谱扫描,2475 荧光检测器的扫描功能,扫描功能 由面板功能执行Empower 英文版亦能由软件执行,荧光检测器使用注意事项,不是所有化合物都有荧光，有时需要衍生检测器对溶解气体及其它“淬灭”物质(如甲醇)敏感,流动相最好能在线脱气对Ex及Em的最佳，易受温度、溶剂极性和粘度、pH及样品浓度影响检测池的耐压较低,注意出口管路要畅通设置的发射波长至少要比激发波长高10nm,流动相脱气与否的信号比较,样品浓度对激发和发射波长的影响,检测器的使用和保养,如长时间不用检测器可以关掉光源灯(UV,FL)仅在4小时以上不用时,才需关灯频繁开关灯也会影响灯寿命不要让缓冲液长期停滞在检测池内用纯水冲洗保存在纯甲醇中示差检测器及荧光检测器若与其它检测器串联使用,应将此两种检测器串在其它检测器的后面不用检测器的液晶显示屏时，应将其亮度调暗,Waters 中国有限公司培训中心,液相色谱教程(四)液相色谱柱基础知识,液相色谱柱基础知识(3),反相色谱柱的选择,Waters 中国有限公司培训中心,液相色谱柱与分离机理的关系,从色谱方法上分正相/反相离子交换分子体积排除亲合疏水回受,从柱子类型上分分配/吸附离子交换凝胶亲合,对HPLC色谱柱的要求(1),合适的选择性满足不同的分离要求良好的色谱峰形重现性宽应用范围,硅胶基质C18填料都相同吗？,色谱实验结果揭示：疏水性不同残留硅羟基活性不同为什么？不同 C18配体键合水平（状况）配体覆盖率不同硅胶颗粒基质密度，表面积，孔径纯度,色谱柱品牌名称,不同色谱柱“品牌名称”表示不同的硅胶基质Waters Symmetry C18Waters Nova-Pak C18相同的“品牌名称”,不同的配体表示相同的硅胶基质，键合相不同Waters Symmetry C18Waters Symmetry C8,注意：由于硅羟基的影响，许多情况下硅胶基质对 整个键合相的性能起决定作用,Minutes,YMC-Pack Pro C18,YMC-Pack Pro C4,二氢苊,萘,对羟基苯甲酸丁酯,提示:相似的选择性归因于相同的硅 胶基质(同一品牌,不同键合相),配体不同的影响：C18与C4,品牌不同的影响:(相同配体),注意:由于硅胶颗粒基质不同(品牌不同),分离的选择性不同,C18键合相硅胶柱填料需要 合适的湿润度,注意：需要有机溶剂来保证反相填料有合适的湿度,反之停流速后易出现“疏水塌陷”问题,未湿润的孔,湿润的孔,注意：保留时间与填料表面积与配体有关。然而，如果硅胶表面未湿润，那么有效的色谱表面积会减少95%，因此，减少被分析物的保留时间即等于“疏水塌陷”，记住：几乎所有的表面积都在孔内！,低比例有机溶剂或纯水溶液流动相,C18 硅胶,什么是“疏水塌陷”？,分,流动相：0.1%醋酸水溶液,阿莫西林,Vo：被分析物没有保留,“湿润时”,“去湿后”,Symmetry C8：疏水塌陷,停流速后(孔去湿:3%),流动相：0.1%醋酸水溶液,SymmetryShield RP8：无疏水塌陷现象发生,内嵌极性基团键合相：使用高比例水溶液流动相时色谱性能稳定,带有极性基团的反相色谱填料,内嵌极性基团配体:可能机理,极性基团增加了填料表层水的浓度,降低碱性物质的保留减少了拖尾改善与水的浸润性,屏蔽了带负电的硅羟基,水表面层机理,水“屏蔽”层,降低了碱性化合物的保留降低了拖尾现象,屏蔽了带负电的硅羟基,SymmetryShield RP18Tf USP=1.1,阿米替林,Symmetry C18Tf USP=1.9,注意：对碱性化合物而言，可以减少保留时间并且改善色谱峰形,相同硅胶基质(配体不同),内置极性基团的配体与直链烷烃配体的比较,注:使用相同的流动相,SymmetryShield RP8,Symmetry C8,选择性不同,呋喃唑酮(痢特灵)杂质分析,色谱柱选择性比较表,(ln k 二氢苊),Hypersil BDS C18,Symmetry C18,Inertsil ODS-2,Inertsil ODS-3,Kromasil C18,YMC-Pack Pro C18,YMC-Pack ODSAQ,Nova-Pak C18,Hypersil ODS,YMC Jsphere ODSH80,YMC Jsphere ODSM80,Nucleosil C18,Bondapak C18,YMC Jsphere ODSL80,Waters Spherisorb ODS1,Resolve C18,Waters Spherisorb ODS2,-0.2,0.3,0.8,1.3,1.8,2.3,2.8,1,1.5,2,2.5,3,3.5,疏水性增加,硅羟基活性降低,(ln a 阿米替林/二氢苊),选择性变化,对HPLC色谱柱的要求(2),合适的选择性良好的色谱峰形定量精度、灵敏度与分离度重现性宽应用范围,USP 拖尾因子（Tailing Factor）:Tf 不对称因子(Assymmetry Factor):As,峰高之5%处,色谱峰对称性的衡量方法,对称峰形的益处,更准确与精确的定量结果纯度分析稳定性分析 更高的灵敏度 更好的检出限与定量限（LOD 和LOQ）对低浓度杂质有更强的检测能力更好的分离度更有利于相邻色谱峰的分离,Waters,21,379,由于拖尾引起的积分误差,由于拖尾引起的灵敏度差异,他莫昔芬0.25 g/mL,信噪比11.06.5,AU,AU,5.00,10.00,Minutes,Conventional C18,峰形对分离度的影响,Rs=(t 峰 2 t峰 1)/0.5(w4.4%峰1+w4.4%峰2)=(11.5-10.6)/0.5(2.0+0.5)=0.72,提示:基线分离的分离度=1.5,不同填料的峰形比较,1.二羟基丙酮2.心得安(T=1.0)3.二氢苊4.阿米替林(T=1.6),1.二羟基丙酮2.心得安(T=5.7)3.二氢苊4.阿米替林(T=7.0),Alltima C8 Symmetry C8,具有良好峰形的Symmetry柱,建立高效液相色谱柱的新标准，开创新一代高品质色谱柱全新的标准：在很宽的pH范围下，对酸、碱及中性化合物均有非常好的色谱峰形极高的批间重现性独特的选择性良好的柱寿命,对HPLC色谱柱的要求(3),合适的选择性良好的色谱峰形重现性色谱柱间重现性批次间重现性宽应用范围,色谱柱重现性的重要性,重现性是液相色谱分析的基本要求缺乏重现性是用户最担心的问题加快方法验证(Validation)的速度更容易传递方法色谱系统之间以及实验室之间确保长期符合认证及系统适应性等要求更容易符合法规要求,同一批次合成的填料色谱柱之间的重现性柱床填充质量控制塔板数色谱峰对称性反压无选择性差异不同批次合成的填料色谱柱批次间重现性颗粒的物理性质表面之化学性质,柱间重现性与批次间重现性的区别,Symmetry 优异的重现性,不同产品批号间的差别最低，充分满足各种严格的cGMP要求孔径RSD=3%渗透性RSD=2%特征表面积RSD=2%平均颗粒度RSD=2%,不同批次间重现性,Symmetry C18,品牌 B,品牌 C,Symmetry C18 45 批,紫杉醇中的不纯物分析:三批色谱柱所得色谱重叠图,不同批次间重现性,Symmetry色谱柱优点,优异的色谱峰形无可比拟的重现性所认证的方法置信度高容易达到法规要求认证方法的长期稳定性有利于长期符合法规要求,对HPLC色谱柱的要求(4),合适的选择性良好的色谱峰形重现性宽应用范围pH 范围温度范围,pH对填料稳定性的影响,高pH实验pH 8时,许多C18硅胶基质过早地丧失柱效由于填料颗粒溶解,色谱柱内产生空隙随着键合相覆盖率的增加，色谱柱寿命延长低pH实验pH 2时,许多C18硅胶基质过早地丧失柱效由于键合相之水解作用,被测物丧失保留行为使用三官能团键合相可获得最佳的稳定性,XTerra 色谱填料,Tetraethoxysilane,(TEOS),Polyethoxysilane,(MPEOS),Methyltriethoxysilane,(MTEOS),杂化颗粒合成(Hybrid particle synthesis),同时含有有机和无机组分拥有介于有机与无机材料 之间的性质,Xterra:Waters 创新的杂化填料,0,10,20,30,40,0,1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,pH,XTerra色谱柱,硅羟基电离,硅羟基不电离,弱保留 好峰形,保留增加 好色谱峰形 必须严格控制pH方可获得良好色谱重现性,保留最强 好色谱峰形 改善色谱重现性,保留因子(k),碱性化合物在不同pH条件下的分离度,灵敏度与选择性的改变,色谱柱:XTerra RP18,4.6.x 150 mm,3.5 m检 测:254 nm(相同进样量)流动相:50%乙腈/40%水/10%含 100 mM CAPSO,pH 10流动相:30%乙腈/60%水/10%含100 mM 磷酸钠,pH 2.0,Minutes,pH 10,色谱图重叠,pH 2 与10：阿司咪唑与 酮康唑分析,简化方法开发过程,1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,pH,中间 pH 硅胶柱,低 pH 硅胶柱,高 pH 聚合物基质柱,宽 pH 范围 XTerra 填料色谱柱,XTerra色谱柱之宽pH范围(以一当三),温度,pH,XTerra填料：高温稳定性,Xterra:高温寿命试验,Conditions:Column:XTerra RP18,5 m,4.6 X 150 mmMobile Phase:40%pH 7,10 mM Na2PO4,60%ACNColumn Temp.:60 CFlow Rate:1.5 mL/minDetector:254 nm,三环抗抑郁药物分离,Xterra色谱柱的优点,XTerra色谱柱为方法开发提供了极其有效且方便的工具宽pH范围良好色谱峰形高稳定性高速度,Waters Patent Technology2000 R&D 100 Award Winner,最新研制的Atlantis反相柱,新型AtlantisTM 填料的性质,提高极性物质保留能力的同时，改善常规反相色谱性能双官能团键合C18(dC18)端基封口平均孔径为100 颗粒度：3,5 及10m,新型AtlantisTM 填料的特点,对极性与非极性化合物的优异保留特性在100水溶液流动相中运行保持色谱性能稳定峰形优异超低键合相流失，质谱兼容酸性条件下稳定性良好双键键合C18，使之：具有较长的色谱柱寿命 低pH条件下稳定性增强极佳的色谱柱间重现性,同时分离极性与非极性化合物,极性化合物在AtlantisTM 色谱柱上保留较强，而非极性物质在其上的保留时间与常规C18色谱柱相似。,1,2,3,4,5,10,9,8,7,6,V,0,=0.98 min,儿茶酚胺及其代谢产物,化合物:1.去甲肾上腺素(NE)2.肾上腺素(E)3.3,4-二羟基苯基丙氨酸(DOPA)4.多巴胺(DA)5.3-甲氧基-4-羟基苯乙二醇(MHPG)6.4-羟基-3-甲氧基苯基乙醇酸(VMA)7.5-羟色胺(5-HT)8.3,4-二羟基苯乙酸(DOPAC)9.5-羟基-3-吲哚乙酸(5HIAA)10.4-羟基-3-甲氧基苯乙酸(HVA),条件色谱柱:4.6 x 150 mm,5 m 流动相 A:H2O流动相 B:ACN流动相 C:100 mM NH4COOH,pH 3.0流速 1.0 mL/min梯度:时间 流动相组成(min)%A%B%C0.00 90 0 105.00 90 0 1015.0 65 25 1020.0 65 25 10进样体积:10 L温度:30oC检测:UV280 nm,水溶性维生素(Vitamins),化合物:USP拖尾因子1.L-抗坏血酸(Vc)1.122.烟酸1.273.硫胺(VB1)1.204.吡哆醛1.135.VB61.046.叶酸1.107.咖啡因1.108.核黄素(VB2)1.14,Time(Min),1.00,2.00,3.00,4.00,5.00,6.00,7.00,8.00,9.00,10.00,11.00,12.00,13.00,14.00,15.00,1,2,3,4,5,8,7,6,V0=1.37 min,条件色谱柱:4.6 x 150 mm,5 m 流动相 A:0.1%TFA流动相 B:乙腈流速:1.4 mL/min梯度:时间 流动相组成(min)%A%B 0.0100 0 4.0 97 3 6.0 85 15 15.0 80 20进样体积:10.0 L温度:30 oC检测:UV 260 nm,反相色谱柱的选择小结:(1),常规应用 现代高纯硅胶色谱柱：SymmetryShield/Symmetry优点：峰形好，重现性高，寿命长限制：pH 2-8流动相中含有大量水溶液采用Shield技术：XTerra RP或Symmetry RP填料Atlantis填料技术优点：在含有大量水溶液（100水溶液）流动相中 性能稳定：峰形好,需要使用宽pH值或高温条件 如生物碱分离XTerra 杂化颗粒技术：pH1-12优点：pH范围宽，高温条件下填料稳定性好，色谱峰 形好，寿命长 采用质谱检测器:窄内径/小颗粒/短柱Xterra MS C18AtlantisSymmetry C18,反相色谱柱的选择小结:(2),需要提高极性物质的保留常规pH：Atlantis dC18极端pH：Xterra：如碱性化合物需要分析分子量较大的多肽或蛋白Symmetry 300C18C4,反相色谱柱的选择小结:(3),结论,各种品牌的C18柱皆有各自不同的选择性,液相色谱教程(七)液相色谱常见问题分析,Waters中国有限公司培训中心,色谱图常见问题,色谱图常见问题主要有三类:色谱峰峰形异常问题例如负峰,宽峰,肩峰,双峰,峰形不对称等色谱图中多峰少峰问题色谱图未出峰,出峰比预想的多等色谱峰保留时间问题保留时间不稳定等,色谱图常见问题分析(一),色谱峰峰形异常问题:所有的峰均为负峰:信号电缆接反或检测器输出极性设置颠倒光学装置尚未达到平衡一个或几个峰是负峰流动相吸收本底高进样过程中进了空气离子对分离中的系统峰样品组分的吸收(RI或UV)低于流动相,色谱图常见问题分析(一),色谱峰峰形异常问题:所有的峰都是宽峰系统未平衡或未达到化学平衡溶样的溶剂比流动相强很多色谱柱类型或尺寸不正确色谱柱或保护柱被污染或降级温度变化对色谱柱的影响,色谱图常见问题分析(一),色谱峰峰形异常问题:较早洗脱的峰呈宽峰进样体积过大或样品浓度太高进样器有问题,定量环(Loop)大小不合适在线过滤器,保护柱,色谱柱或管路堵塞管路问题:内径不对或切管不正确管路连接问题:接头或锥箍不正确检测器时间常数不正确,色谱图常见问题分析(一),色谱峰峰形异常问题:峰比预想的要小样品粘度过大进样器有问题或进样体积有误检测器设置不正确,定量环(Loop)体积不正确检测器输出未置零用了不正确的检测器输出信号检测池被污染检测器的灯可能有问题,色谱图常见问题分析(一),色谱峰峰形异常问题:双峰或肩峰进样量或样品浓度过大保护柱或色谱柱进口堵塞保护柱或色谱柱污染或失效前伸峰进样量或样品浓度过大溶样的溶剂相对于流动相太强保护柱或色谱柱污染或失效,色谱图常见问题分析(一),色谱峰峰形异常问题:平头峰检测器设置不正确进样体积太大或样品浓度太高拖尾峰保护柱或色谱柱问题:污染或失效进样问题检测器时间常数不正确,拖尾是由什么引起的?,混合型保留机理与键合相的疏水作用与带电点的离子交换作用,缓冲液的 pH与拖尾,色谱图常见问题分析(二),色谱图多峰少峰问题:色谱图中未出峰:进样问题:未进样或样品分解流动相问题:泵未输液或流动相不正确检测器设置不正确,或检测器有问题,色谱图常见问题分析(二),色谱图多峰少峰问题:色谱图中出峰比预想的少样品分解色谱柱分辨率丧失用错流动相梯度洗脱时平衡不足(例如,过早将手动进样器扳至(Load)位置,色谱图常见问题分析(二),色谱图多峰少峰问题:色谱图中出峰比预想的多(鬼峰):样品分解或制样时导入了杂质流动相被污染,或用错流动相流动相中含有稳定剂或稳定剂发生变化前次进样的后流出物(某些Rt值特大的组分)进样器被污染,洗针系统出问题或注射器脏未充分平衡进样器Loop管保护柱脏,色谱柱被污染,分辨率下降,色谱图常见问题分析(三),色谱峰保留时间问题:保留时间飘忽不定(各次运行之间)系统不稳定或未达化学平衡泵压力不稳(泵头里有气泡)进样体积过大或样品浓度过大温度波动流动相混合不均匀色谱柱被污染,色谱图常见问题分析(三),色谱峰保留时间问题:保留时间增加或减少(各次运行之间)系统不稳定或化学平衡不足泵流速变化温度变化色谱柱污染,柱效下降流动相被污染溶剂入口过滤器堵或管路堵塞系统渗漏,色谱图常见问题分析(三),色谱峰保留时间问题:保留时间改变到一个新的恒定值流动相不正确或其组成不正确泵流速变化实际输液的流速不正确(泵失灵或故障)环境温度变化；柱温不正确色谱柱尺寸或类型不正确色谱柱被污染流动相含有稳定剂或稳定剂发生变化输液系统的梯度滞后体积不正确,HPLC实验中常见问题,系统压力问题压力高压力低或没有压力压力不稳流路基线噪音问题基线不稳定(不重复)长、短程振荡基线漂移噪音脉冲尖刺,HPLC常见问题分析,系统压力问题压力高的原因温度太低流速太高流动相粘度大管路堵塞仪器或色谱柱堵塞压力传感器问题,系统压力问题压力低或没有压力温度太高;流速太低泵关闭或保险丝断了泵未输送流动相系统内有渗漏处所用溶剂不正确自动进样器在Purge时卡住,HPLC常见问题分析,系统压力问题压力低或没有压力（续）储液瓶中无溶剂 低压限设置不当泵未正确排气溶剂入口过滤头堵 入口管路中有空气泵失效,HPLC常见问题分析,系统压力问题压力不稳压力传感器问题泵排气不充分泵失效流动相未正确脱气所用溶剂不混溶或易挥发,HPLC常见问题分析,流路基线噪音问题基线不稳定(不重复)检测池中有大的气泡流路中有小气泡流过系统未稳定或未达到化学平衡流动相被污染检测器流动池漏色谱柱污染,HPLC常见问题分析,流路基线噪音问题基线漂移系统不稳或未化学平衡温度波动流动相未正确脱气流动相被污染;流动相中有稳定剂或稳定剂变化检测器流动池漏;系统中有渗漏色谱柱污染;固定相渗漏选用不正确的检测波长(相对于溶剂)有迟流出的组分,HPLC常见问题分析,流路基线噪音问题短程振荡泵压不稳泵入口管松,弯或堵塞溶剂混合不充分检测池中有大气泡泵入口阀脏或失效泵柱塞杆密封垫磨损检测器出口溶液成滴状流入废液瓶,HPLC常见问题分析,流路基线噪音问题长程振荡温度波动溶剂被循环通过系统噪音脉冲尖刺流路中有小气泡泵头有气泡空腔入口阀脏或失效检测池中有小颗粒物泵或检测器未正确接地,HPLC常见问题分析,判断故障与故障排除的原则,规则一确认问题至少发生两次以上。如果问题 不重复出现，很难证实其确实为问题规则二从最简单的因素入手规则三一次只变化一个因素，以使你能够确认 所变因素与问题之间的关联,判断故障与故障排除的原则,规则四恢复原状。如果使用更换组件方法来 查找问题之所在,完毕后应将原有完 好组件安装回原处。否则,换下的组 件将来很难再利用,会造成浪费规则五养成记录的好习惯。一个完整的好记 录是成功地进行故障排除的关键,