2017年细胞周期调控.ppt
细胞周期调控cell cycle regulation,细胞增殖周期，简称细胞周期(cell cycle)，是指连续分裂的细胞从上一次有丝分裂结束开始到下一次有丝分裂结束为止所经历的整个序列过程。这个过程所需要的时间称为细胞周期时间。,细胞周期,细胞周期周而复始地进行着，这种周期性的重复过程受到严格地控制，使得不同的细胞周期事件在空间和时间上相互协调。,研究背景 细胞周期的检验点 细胞周期蛋白 CDK及其调控 生长因子、癌基因和抑癌基因 细胞周期与肿瘤,内容提要,一、研究背景 1.MPF的发现及其作用1960年，Masui和Markert研究爪蟾卵母细胞，提出了成熟卵母细胞中存在一种促成熟因子（maturation promoting factor，MPF）。Rao和Johnson(1970、1972、1974)以Hela细胞为材料，发现M期细胞具有某种促进间期细胞进行分裂的因子，即促细胞分裂因子(mitosis-promoting factor，MPF)。,2.cdc基因Leland Hartwell、Paul Nurse分别以不同的酵母为实验材料，发现了许多与细胞分裂有关的基因(cell division cycle gene，CDC)。如芽殖酵母的cdc28、裂殖酵母cdc2基因。进一步研究发现：P34cdc2与P34cdc28是同源物，二者本身并不具有激酶活性，只有当其与有关蛋白结合后，其激酶活性才能够表现出来。例如：P34cdc2必须与另一种蛋白P56cdc13结合后才具有激酶活性。,3.cyclin 1983年Timothy Hunt首次发现海胆卵受精后，在其卵裂过程中两种蛋白质的含量随细胞周期剧烈振荡，在每一轮间期开始合成，G2/M时达到高峰，M结束后突然消失，在下一个周期中又重复这一消长现象，故命名为周期素或周期蛋白(cyclin)。随后cyclin很快被分离和克隆出来，证明其广泛存在于从酵母到人类等各种真核生物中，而且在功能上存在互补性。,4.MPF P34cdc2Cyclin？1988年M.J.Lohka 纯化了爪蟾的MPF，经鉴定由34KD和45KD两种蛋白组成，二者结合可使多种蛋白质磷酸化。1990 Paul Nurse进一步的实验证明P34实际上是P34cdc2的同源物，P45是cyclinB的同源物，而且，对于P34cdc2的活性而言，cyclin是必需的。从而将细胞周期三个领域的研究联系在一起。,for their discoveries of key regulators of the cell cycle,Leland Hartwell,Timothy Hunt,Paul Nurse,二、细胞周期的检验点1989年，Hartwell通过构建酵母细胞突变模型证实了细胞周期检验点（check point）的存在，并首次提出检验点的概念。细胞周期的运行，是在一系列检验点的严格检控下进行的，它保证前一个事件完成之后，才启动下一个事件，检查点是细胞的错误监测机制。,G1/S检验点：在酵母中称start点，在哺乳动物中称R点(restriction point)，控制细胞由静止状态的G1进入DNA合成期，相关的事件包括：DNA是否损伤？细胞外环境是否适宜？细胞体积是否足够大？S期检验点：DNA复制是否完成？,G2/M检验点：是决定细胞一分为二的控制点，相关的事件包括：所有DNA都正确复制了吗？DNA是否有损伤？细胞体积是否足够大？中-后期检验点（纺锤体组装检验点）：所有染色体都排列在纺锤体上了吗？任何一个着丝点没有正确连接到纺锤体上，引起细胞周期中断。,三、细胞周期蛋白cyclin 的种类繁多，目前从芽殖酵母、裂殖酵母和各类动物中分离出的周期蛋白有30余种，在脊椎动物中为A1-2、B1-3、C、D1-3、E1-2、F、G、H等。分别参与细胞周期中不同时相的调节。分为G1型、G1/S型S型和M型4类。,人类细胞周期蛋白线性结构示意图实心方框代表“cyclin box”，方框代表“destruction box”圆形框代表PEST序列,cyclin box：各类周期蛋白均含有一段约100个氨基酸的保守序列，称为周期蛋白盒(cyclin box)，介导周期蛋白与CDK(cyclindependent kinase)结合。,Cyclin也含有降解盒（destruction box）或PEST（脯氨酸谷氨酸丝氨酸苏氨酸）序列，它可以通过定时降解或恒定地迅速周转来调节这些蛋白质的水平，起着CDK的调节亚基的作用。,G1期：细胞在生长因子的刺激下，G1期cyclin D表达，并与CDK4、CDK6结合，使下游的蛋白质如Rb磷酸化，磷酸化的Rb释放出转录因子E2F，促进许多基因的转录。,Cyclin D与CDK结合使Rb释放结合的转录因子E2F,G1/S期：cyclinE与CDK2结合，促进细胞通过G1/S限制点而进入S期。向细胞内注射CyclinE的抗体能使细胞停滞于G1期，说明细胞进入S期需要CyclinE的参与。,S期：将CyclinA的抗体注射到细胞内，发现 能抑制细胞的DNA合成，推测CyclinA是DNA复 制所必需的。,G2/M期：cyclinA、cyclinB与CDK1结合，CDK1使底物蛋白磷酸化,如将组蛋白H1磷酸化导致染色体凝缩，核纤层蛋白磷酸化使核膜解体等下游细胞周期事件。,M期：在分裂中期当MPF活性达到最高时，通过一种未知的途径，激活后期促进因子APC(anaphase promoting complex)，负责将泛素连接在cyclinB上，导致cyclinB被蛋白酶体（proteasome）降解，完成一个细胞周期。,哺乳动物细胞周期中各时相不同cyclin的作用,四、CDK及其调控 CDK即细胞周期蛋白依赖性激酶(cyclindependent kinase,CDK)，控制着细胞周期各期之间的顺序转换。CDK是一组相关联的Ser/Thr蛋白激酶，酵母中细胞周期的进程主要由单一的CDK（P34cdc2/cdc28）所控制。多细胞生物中，细胞周期各期之间的转换需要不同的CDK。,脊椎动物的CDK,*P35，P36的结构与细胞周期蛋白无相似性,1Cyclin的结合是CDK激活的第一步 CDK活性的最初调节者是cyclin亚单位。Cyclin与相应的CDK结合后，引起CDK空间构象改变，暴露其催化亚基。各种细胞周期蛋白程序化的合成和降解保证各对应CDK适时的活化，维持细胞周期的正确时序。,2CDK的磷酸化与去磷酸化 以P34cdc2(CDK1)为例，如果对P34cdc2磷酸化作用位点不同，则对该酶的活性分别产生正向和负向的控制。完整的P34cdc2-cyclin复合物需要磷酸化才能被激活，驱动细胞进入有丝分裂。,P34cdc2的Thr14和Tyr15的磷酸化引起P34cdc2-cyclin复合物的失活，Weel是催化Tyr15磷酸化的激酶，另有一个是Thr14磷酸化的激酶；催化Thr14及Tyr15 脱磷酸化的蛋白磷酸酶为双特异性磷酸酶Cdc25蛋白。,P34cdc2的Thr161的磷酸化是酶的活性所必需的。CDKs活化激酶CAK（CDKs activiting kinase）应答Thr161的磷酸化，这是另一种蛋白激酶CDK7-Cyclin H复合物。当磷酸酶-1将此位点的磷酸水解，P34cdc2又失去激酶活性。,3CDK抑制剂的作用除了磷酸化去磷酸化可以调节MPF活性外，另有一类CDK抑制因子（CDC kinase inhibitor,CKI）可与CDK结合抑制其活性。,（1）Ink4(Inhibitor of cdk 4)如P16ink4a、P15ink4b、P18ink4c、P19ink4d，专一地与CDK4、CDK6结合，阻止CDK和cyclinD的结合。使细胞周期不能从G1期的调控点进入到下一个时相。,（2）Cip/Kip 包括P21cip1(cyclin inhibition protein 1)、P27kip1(kinase inhibition protein 1)、P57kip2等，能与多种cyclin-CDK复合物包括cyclinECDK2、cyclinDCDK6、cyclinDCDK4结合，抑制cyclin-CDK复合物的蛋白激酶活性，使一些细胞增殖所需要的蛋白质磷酸化受阻，细胞停留在G1期。,此外P21cip1还可与DNA聚合酶亚单位PCNA(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)相互作用，抑制DNA复制，但不影响DNA修复。,CDK1的激活需要Thr14和Tyr15去磷酸化和Tyr161的磷酸化,五、生长因子、癌基因和抑癌基因1生长因子 生长因子是促细胞周期运行的重要因子。RTK-Ras-MAPK信号传递途径是细胞外的信号传递到细胞核内最基本的途径。,2癌基因 原癌基因被激活，其编码蛋白大量表达，这些蛋白对细胞周期具有促进作用。,癌基因的主要类型及其表达产物,3抑癌基因 抑癌基因可抑制细胞周期于静止期，并使DNA复制不完全或损伤的细胞不能进入分裂期，避免细胞的癌变。,（1）P53一般情况下，细胞中很少有P53蛋白。DNA损伤会引起P53蛋白浓度和活性的提高。P53蛋白可同P21基因调节区结合，激活P21基因转录。使细胞停滞在G1期的调控点处不能进入S期。这样，即可有足够的时间修复DNA。,P53蛋白可促进GADD45基因（growth arrest and DNA damage inducible gene）表达生成GADD45蛋白，后者与CDK及PCNA形成的复合物，参与DNA损伤的修复。当DNA损伤不能修复时，p53基因的过量表达导致P34cdc2的过早激活，结果使核膜破裂，引起细胞凋亡。,（2）RbRb基因位于人染色体13q14，由27个外显子构成，分布在总长180-200kb以上的DNA片段上。Rb基因转录的mRNA大小为4.7 kb，编码一个分子量为105kD的蛋白质，由928个氨基酸残基构成，定位于细胞核内，是多种cyclin-CDK的底物，具有多个被磷酸化的位点。,Rb有高、低磷酸化两种状态。低磷酸化的Rb蛋白可与一些转录因子如E2F结合，抑制这些转录因子的活性，阻止细胞的生长。而高磷酸化状态则失去这种功能，使E2F游离，进入核内，发挥转录活性，促进细胞周期进行。,Rb在细胞周期内的磷酸化,六、细胞周期与肿瘤,肿瘤细胞最显著的特点是生长失控和幼稚化（即不分化）。,（一）肿瘤细胞周期失控的分子基础 1细胞周期蛋白异常,G1cyclin基因突变、重排，使这些cyclin异常表达，从而使细胞通过G1期，进入S期，细胞即自发增殖，出现转化特征。许多人类肿瘤中，均发现有cyclin D1基因的扩增。,B型肝炎病毒（hepatitis B virus,HVB）感染人体后成为导致肝癌的因素之一，有研究发现，HVB基因组整合入cyclinA基因的一个内含子中，产生异常、过量表达的转录物。和正常的cyclinA相比，它缺少N端的“destruction box”，逃脱了对它的降解，大量异常的cyclinA刺激细胞增殖。,2CDK和CKI基因的突变 研究中发现肿瘤细胞CDK的水平一般较高，而CKI基因常见纯合性缺失突变，细胞内缺少CKI，或CKI抑制CDK功能的丧失。,3抑癌基因突变 不少癌细胞中发现Rb或P53基因发生了突变，使Rb失去了阻断mRNA转录，P53失去了使细胞休止在G1后期的功能，造成细胞周期失控。,（二）细胞周期与肿瘤的基因治疗 1抑制G1期cyclins的过度表达 G1期cyclins反义核酸，在体外和裸鼠体内都可抑制肺癌的增殖。反义DNA可以与基因结合而阻止基因的转录，反义的RNA可与mRNA结合，而抑制其翻译，都可以达到抑制肿瘤细胞增殖的目的。RNA干扰(RNA interference，RNAi)是将双链RNA导入细胞内引起特异基因的mRNA降解的一种细胞反应过程。属于转录后基因沉默的一种。,2促使肿瘤细胞表达正常的CKIs有报道用正常的P16、P21、P27基因与腺病毒载体重组，将重组的腺病毒导入肿瘤细胞，重组的腺病毒在肿瘤细胞内表达有功能的P16、P21和P27蛋白，抑制CDKs的活性，使肿瘤细胞停止在G0G1，抑制肿瘤细胞增殖。,3抑制E2F的活性把对E2F有高度亲和性的双链DNA片段导入细胞，该DNA能够结合游离状态的E2F生成一种复合物，复合物中的E2F不再与有关基因的启动子结合，从而阻断这些基因的表达，抑制细胞增生。,思考题,名词：cyclin box、R点问答：1.简述细胞周期各时相cyclin的种类及作用。2.简述细胞周期的主要检验点（check point）及功能。,非洲爪蟾卵细胞发育过程分为六个阶段、和期。前四个时期为卵母细胞生成和生长阶段。其中第期时细胞核较大，称为生发泡(germinal vesicle,GV)，此时细胞就停留在该时期，等待成熟。,实验表明：成熟卵细胞的细胞质中必然有一种物质，可以诱导卵母细胞成熟，称之为促成熟因子（maturation promoting factor，MPF）。,G1期PCC为单线状，因DNA未复制。S期PCC为粉末状，因DNA由多个部位开始复制。G2期PCC为双线染色体，说明DNA复制已完成。,与M期细胞融合的间期细胞产生了形态各异的早熟凝集染色体(prematurely condensed chromosome，PCC)，这种现象叫做早熟染色体凝集(premature chromosome condensation),人M期细胞与袋鼠（Ptk）G1、S、G2期细胞融合诱导PCC,不仅同类M期细胞可以诱导PCC，不同类的M期细胞也可以诱导PCC产生。,芽殖酵母及其细胞周期,L.Hartwell在芽殖酵母中发现cdc28基因的表达产物是一种相对分子量为34KD的蛋白，被称为P34cdc28，它是一种蛋白激酶，在G2/M转换过程中起中心调节作用。,裂殖酵母及其细胞周期,P.Nurse在裂殖酵母中发现cdc2基因的表达产物也是一种相对分子量为34KD的蛋白，被称为P34cdc2,进一步研究发现，P34cdc2具有激酶活性，可使多种蛋白底物磷酸化，在裂殖酵母周期调控中起关键性调节作用。,
