酶的分类与命名.ppt

第三章 酶,第三章 酶,第一节 酶的分类与命名 第二节 酶催化作用的特性 第三节 酶催化作用的机制 第四节 酶结构与功能的关系 第五节 酶促反应动力学 第六节 酶活力及其测定 第七节 酶工程,酶是生物催化剂,酶是活细胞产生的一类具有催化功能的生物分子，所以又称为生物催化剂(biocatalysts）绝大多数的酶都是蛋白质。酶催化的生物化学反应，称为酶促反应（Enzymatic reaction）。在酶的催化下发生化学变化的物质，称为底物（substrate）。,1926年,James Summer由刀豆制出脲酶结晶确立酶是蛋白质的观念，其具有蛋白质的一切性质。核酶的发现：19811982年，Thomas R.Cech实验发现有催化活性的天然RNARibozyme。L19 RNA和核糖核酸酶P的RNA组分具有酶活性是两个最著名的例子。抗体酶（abzyme）：1986年，Richard Lerrur和Peter Schaltz运用单克隆抗体技术制备了具有酶活性的抗体（catalytic antibody）。,第一节 酶的分类与命名,一 酶的分类（一）根据酶的化学组成可将酶分为：1 单纯蛋白酶类：只含有蛋白质成分 2 结合蛋白酶类（全酶）：含有蛋白成分（酶蛋白）和非蛋白成分（辅助因子）,全酶=酶蛋白+辅助因子,辅助因子,与酶蛋白结合比较疏松的小分子有机物,与酶蛋白结合紧密的小分子有机物。,金属离子作为辅助因子。,金属离子,辅酶,辅基,酶蛋白和辅助因子单独存在均无催化活性，只有二者结合为全酶才有催化活性。酶蛋白决定酶催化专一性，辅助因子通常是作为电子、原子或某些化学基团的载体决定反应的性质。,某些小分子有机化合物与酶蛋白结合在一起并协同实施催化作用，这类分子被称为辅酶（或辅基）。辅酶是一类具有特殊化学结构和功能的化合物。参与的酶促反应主要为氧化-还原反应或基团转移反应。大多数辅酶的前体主要是水溶性 B 族维生素。许多维生素的生理功能与辅酶的作用密切相关。,辅酶在酶促反应中的作用特点,辅酶在催化反应过程中，直接参加了反应。每一种辅酶都具有特殊的功能，可以特定地 催某一类型的反应。同一种辅酶可以和多种不同的酶蛋白结合形成不同的全酶。一般来说，全酶中的辅酶决定了酶所催化的类型（反应专一性），而酶蛋白则决定了所催化的底物类型（底物专一性）。,酶分子中的金属离子,根据金属离子与酶蛋白结合程度，可分为两类：金属酶和金属激酶。在金属酶中,酶蛋白与金属离子结合紧密。如 Fe2+/Fe3+、Cu+/Cu3、Zn2+、Mn2+、Co2 等。金属酶中的金属离子作为酶的辅助因子，在酶促反应中传递电子，原子或功能团。,金属酶中的金属离子与配体,金属离子 配体 酶或蛋白Mn2 咪唑 丙酮酸脱氢酶Fe2+/Fe3+卟啉环，咪唑，血红素，含硫配体 氧化-还原酶，过氧化氢酶Cu+/Cu2+咪唑，酰胺 细胞色素氧化酶Co2+卟啉环 变位酶Zn2+-NH3，咪唑，（-RS）2 碳酸酐酶，醇脱氢酶Pb2-SH d-氨基-g-酮戊二酸脱水酶Ni2-SH 尿酶,金属激酶中的金属离子,激酶是一种磷酸化酶类，在ATP存在下催化葡萄糖，甘油等磷酸化。其中的金属离子与酶的结合一般较松散。在溶液中，酶与这类离子结合而被激活。如Na+、K+、Mg2+、Ca2+等。金属离子对酶有一定的选择性,某种金属只对某一种或几种酶有激活作用。,（二）根据酶蛋白结构特点可将酶分为,单体酶：以一个独立的三级结构为完整生物 功能分子的最高结构形式的酶。寡聚酶：以一个独立的四级结构为完整生物 功能分子的最高结构形式的酶。多酶复合体：由多种酶彼此镶嵌成一个功能 完整的具有特定结构的复合体,它们相互配合依次进行，催化连续的 一系列相关反应。,（三）、酶的分类 根据酶所催化的反应类型，按照国际系统 分类方法，将酶分为六大类：,氧化-还原酶催化氧化-还原反应。主要包括脱氢酶(dehydrogenase)和氧化酶(Oxidase)。如，乳酸(Lactate)脱氢酶催化乳酸的脱氢反应。,1 氧化-还原酶 Oxidoreductase,AH2+B（O2）,+BH2（H2O2，H2O）,A,转移酶催化基团转移反应，即将一个底物分子的基团或原子转移到另一个底物的分子上。例如，谷丙转氨酶催化的氨基转移反应。,2 转移酶 Transferase,AX+B,A+BX,水解酶催化底物的加水分解反应。主要包括淀粉酶、蛋白酶、核酸酶及脂酶等。例如，脂肪酶(Lipase)催化的脂的水解反应：,3 水解酶 hydrolase,AOH+BH,AB+H2O,裂合酶催化从底物分子中移去一个基团或原子形成双键的反应及其逆反应。主要包括醛缩酶、水化酶及脱氨酶等。例如，延胡索酸水合酶催化的反应。,4 裂合酶 Lyase,异构酶催化各种同分异构体的相互转化，即底物分子内基团或原子的重排过程。例如，6-磷酸葡萄糖异构酶催化的反应。,5 异构酶 Isomerase,常见的有消旋和变旋、醛酮异构、顺反异构和变位酶类。,合成酶，又称为连接酶，能够催化C-C、C-O、C-N 以及C-S 键的形成反应。这类反应必须与ATP分解反应相互偶联。A+B+ATP+H-O-H=A B+ADP+Pi 例如，丙酮酸羧化酶催化的反应。丙酮酸+CO2 草酰乙酸,6 合成酶 Ligase or Synthetase,核酸酶是唯一的非蛋白酶。它是一类特殊的RNA，能够催化RNA分子中的磷酸酯键的水解及其逆反应。,7核酸酶（催化核酸）ribozyme,（一）习惯命名方法（1）根据作用底物来命名，如淀粉酶、蛋白酶等。（2）根据所催化的反应的类型命名，如脱氢酶、转移酶等。（3）两个原则结合起来命名，如丙酮酸脱羧酶等。（4）根据酶的来源或其它特点来命名，如胃蛋白酶、胰蛋白酶等。,二 酶的命名,（二）国际系统命名法,系统名称包括底物名称、构型、反应性质，最后加一个酶字。,例如：习惯名称:谷丙转氨酶系统名称:丙氨酸：-酮戊二酸氨基转移酶酶催化的反应:谷氨酸+丙酮酸-酮戊二酸+丙氨酸,酶的编码,每个酶都有一个有四个数字组成的编码,第二节 酶催化作用的特性,酶是生物催化剂，与无机催化剂相比，二者 有共性；但酶的化学本质是蛋白质，又在生物体内作用，因此酶的作用又有特性。,一 酶和一般催化剂的共性,1.用量少而催化效率高；2.它能够改变化学反应的速度，但是不能改变化学反应平衡。3.只能催化热力学允许的反应，在反映前后不发生改变。,二 酶催化作用特性,1高效性2专一性3反应条件温和4.酶的催化活性可调节控制,二 酶催化作用特性,酶的催化作用可使反应速度提高106-1012倍。例如：过氧化氢分解 2H2O2 2H2O+O2用Fe+催化，效率为6*10-4 mol/mol.S，而用过氧化氢酶催化，效率为6*106 mol/mol.S。用-淀粉酶催化淀粉水解，1克结晶酶在65C条件下可催化2吨淀粉水解。,1高效性,酶的专一性 Specificity又称为特异性，是指酶在催化生化反应时对底物的选择性。根据专一性的不同又可分为：（1)绝对专一性（2）相对专一性（3）立体异构专一性,2专一性,（1）绝对专一性,有些酶对底物的要求非常严格，只作用于一个特定的底物。这种专一性称为绝对专一性（Absolute specificity)。,有些酶的作用对象不是一种底物，而是一类化合物或一类化学键。这种专一性称为相对专一性(Relative Specificity)。包括族(group)专一性。如-葡萄糖苷酶，催化由-葡萄糖所构成的糖苷水解，但对于糖苷的另一端没有严格要求。和键(Bond)专一性。如酯酶催化酯的水解，对于酯两端的基团没有严格的要求。,（2）相对专一性,（3）立体化学专一性,酶的一个重要特性是能专一性地与手性底物结合并催化这类底物发生反应。例如，淀粉酶只能选择性地水解D葡萄糖形成的1，4糖苷键,I,光学专一性 Optical Specificity,Stereochemical Specificity,几何专一性,有些酶只能选择性催化某种几何异构体底物的反应，而对另一种构型则无催化作用。如延胡索酸水合酶只能催化延胡索酸水合生成苹果酸，对马来酸则不起作用。,geometrical specificity,酶促反应一般在pH 5-8 水溶液中进行，反应温度范围为20-40C。高温或其它苛刻的物理或化学条件，将引起酶的失活。,3反应条件温和,4.酶的催化活性可调节控制,如抑制剂调节、共价修饰调节、反馈调节、酶原激活及激素控制等。,某些酶催化活力与辅酶、辅基及金属离子有关。,第三节酶结构与功能的关系,酶的化学本质是蛋白质，同样具有一、二、三级结构，有些酶还具有四级结构。作为生物催化剂，酶的结构又有一些特点。,第三节 酶结构与功能的关系,一 活性部位：酶分子中直接与底物结合，并催化底物发 生 反应的部位。酶活性中心包括两个部位。,主要包括：亲核性基团：丝氨酸的羟基，半胱氨酸的巯基和组氨酸的咪唑基。,必需基团：在酶分子中和酶的催化活性直接有关的基团，活性中心内外都有。,酸碱性基团：门冬氨酸和谷氨酸的羧基，赖氨酸的氨基，酪氨酸的酚羟基，组氨酸的咪唑基和半胱氨酸的巯基等。,必需基团：,二 变构酶,亦称别构酶，由两个以上亚基组成，除了具有与底物结合的活性中心外，还具有与调节剂结合的调节中心。当酶与调节剂结合后，酶蛋白的构象发生变化，从而引起酶活性的变化。,酶的别构（变构）效应示意图,一般是寡聚酶，由多亚基组成，包括催化部位和调节（别构）部位；具有别构效应。指酶和一个配体（底物，调节物）结合后可以影响酶和另一个配体（底物）的结合能力。,相同（均为底物）：同促效应（homotropic effect）,不同（效应调节物）：异促效应（heterotropic effect）,根据配体结合后对后继配体的影响,根据配体性质,正协同效应（positive cooperative effect）,负协同效应（negative cooperative effect）,动力学特点：不符合米曼方程双曲线。,别构酶的特点,别构酶与非调节酶动力学曲线的比较,别构酶举例：天冬氨酸转氨甲酰酶，简称ATCase,三 酶原及酶原的激活,1 酶原：酶无活性的前体。,2 酶原的激活：从无活性的酶原转变为有活性的酶的过程。,4酶原激活的本质：酶原的激活实质上是酶活性部位形成或暴露的过程。,3 激活剂：能使无活性的酶原激活的物质。,胰蛋白酶原,胰蛋白酶,六肽,肠激酶,活性中心,胰蛋白酶原的激活示意图,胰蛋白酶原,胰蛋白酶,六肽,肠激酶,胰蛋白酶对各种胰脏蛋白酶的激活作用,四 同工酶(isoenzyme),能催化相同的化学反应，但在蛋白质分子的结构、理化性质和免疫性能等方面都存在明显差异的一组酶。,乳酸脱氢酶（LDH),LDH5,LDH4,LDH3,LDH2,LDH1,骨肌型,心肌型,乳酸脱氢酶同工酶形成示意图,多肽,亚基,mRNA,四聚体,结构基因,a b,不同组织中LDH同工酶的电泳图谱,同工酶在各学科中的应用,(1)遗传学和分类学：提供了一种精良的判别遗传标志的工具。,(2)发育学：有效地标志细胞类型及细胞在不同条件下的分化情况，以及个体发育和系统发育的关系。,(3)生物化学和生理学：根据不同器官组织中同工酶的动力学、底物专一性、辅助因子专一性、酶的变构性等性质的差异，从而解释它们代谢功能的差别。,（4）医学和临床诊断：体内同工酶的变化，可看作机体组织损伤，或遗传缺陷，或肿瘤分化的的分子标志。,第四节 酶的催化作用机理,酶促反应：E+S=ES=ES*EP E+P 反应方向,主要取决于反应自由能变化H。而反应速度快慢,则主要取决于反应的活化能Ea。,（一）活化能降低,催化剂的作用是降低反应活化能Ea,从而起到提高反应速度的作用,一 酶作用高效率的机制,反应过程中能的变化,一 酶作用高效率的机制,（二）中间产物学说 在酶催化的反应中，第一步是酶与底物形成酶底物中间复合物。当底物分子在酶作用下发生化学变化后，中间复合物再分解成产物和酶。E+S=E-S P+E许多实验事实证明了ES复合物的存在。ES复合物形成的速率与酶和底物的性质有关。,酶（E）与底物（S）结合生成不稳定的中间物（ES），再分解成产物（P）并释放出酶，使反应沿一个低活化能的途径进行，降低反应所需活化能，所以能加快反应速度。,酶催化作用的本质是酶的活性中心与底物分子通过短程非共价力(如氢键,离子键和疏水键等)的作用，形成E-S反应中间物，其结果使底物的价键状态发生形变或极化，起到激活底物分子和降低过渡态活化能作用。,在酶促反应中，底物分子结合到酶的活性中心，一方面底物在酶活性中心的有效浓度大大增加，有利于提高反应速度；另一方面，由于活性中心的立体结构和相关基团的诱导和定向作用，使底物分子中参与反应的基团相互接近，并被严格定向定位，使酶促反应具有高效率和专一性特点。,1 邻基效应和定向效应,(三)与酶作用高效性有关的因素,邻 近 定 向 效 应,2 与反应过渡状态结合作用,按 SN2 历程进行的反应，反应速度与形成的过渡状态稳定性密切相关。在酶催化的反应中，与酶的活性中心形成复合物的实际上是底物形成的过渡状态，所以，酶与过渡状态的亲和力要大于酶与底物或产物的亲和力。,3 张力学说,这是一个形成内酯的反应。当 RCH3时，其反应速度比 RH的情况快315倍。由于-CH3体积比较大，与反应基团之间产生一种立体排斥张力，从而使反应基团之间更容易形成稳定的五元环过渡状态。,4 酸碱催化,酸-碱催化可分为狭义的酸-碱催化和广义的酸-碱催化。酶参与的酸-碱催化反应一般都是广义的酸碱催化方式。广义酸碱催化是指通过质子酸提供部分质子,或是通过质子碱接受部分质子的作用，达到降低反应活化能的过程。,广义酸基团 广义碱基团（质子供体）（质子受体）,酶分子中可以作为广义酸、碱的基团,His 是酶的酸碱催化作用中最活泼的一个催化功能团。,5.共价催化,催化剂通过与底物形成反应活性很高的共价过渡产物，使反应活化能降低，从而提高反应速度的过程，称为共价催化。酶中参与共价催化的基团主要包括 His 的咪唑基，Cys 的硫基，Asp 的羧基，Ser 的羟基等。某些辅酶，如焦磷酸硫胺素和磷酸吡哆醛等也可以参与共价催化作用。,6 金属离子催化作用,金属离子可以和水分子的OH-结合，使水显示出更大的亲核催化性能。,提高水的亲核性能,电荷屏蔽作用,电荷屏蔽作用是酶中金属离子的一个重要功能。多种激酶(如磷酸转移酶)的底物是Mg2+ATP复合物。,电子传递中间体,许多氧化-还原酶中都含有铜或铁离子，它们作为酶的辅助因子起着传递电子的功能。,二 酶作用专一性的机制,酶分子活性中心部位，一般都含有多个具有催化活性的手性中心，这些手性中心对底物分子构型取向起着诱导和定向的作用，使反应可以按单一方向进行。酶能够区分对称分子中等价的潜手性基团。(a)“三点结合”的催化理论。认为酶与底物的结合处至少有三个点，而且只有一种情况是完全结合的形式。只有这种情况下，不对称催化作用才能实现。,锁 钥 学 说,锁钥学说：,认为整个酶分子的天然构象是具有刚性结构的，酶表面具有特定的形状。酶与底物的结合如同一把钥匙对一把锁一样,诱导契合学说,诱导契合学说,该学说认为酶表面并没有一种与底物互补的固定形状，而只是由于底物的诱导才形成了互补形状.,第五节 酶促反应动力学,定义：酶促反应动力学是研究酶促反应速度以及各种条件下对酶反应速度的影响。,在低底物浓度时,反应速度与底物浓度成正比，为一级反应。底物浓度增大与速度的增加不成正比,为混合级反应.当底物浓度达到一定值，几乎所有的酶都与底物结合后，反应速度达到最大值（Vmax），此时再增加底物浓度，反应速度不再增加，表现为零级反应。,一 底物浓度对酶促反应速度的影响,(一)V-S曲线,1913年，德国化学家Michaelis和Menten根据中间产物学说对酶促反映的动力学进行研究，推导出了表示整个反应中底物浓度和反应速度关系的著名公式，称为米氏方程。,Km 米氏常数Vmax 最大反应速度,（二）米氏方程,根据中间产物学说，酶促反应分两步进行:,米氏方程的推导：,米氏方程,Km 即为米氏常数，Vmax为最大反应速度,当反应速度等于最大速度一半时,即V=1/2 Vmax,Km=S 上式表示,米氏常数是反应速度为最大值的一半时的底物浓度。因此,米氏常数的单位为mol/L。,（三）米氏常数的意义及测定,米氏常数Km的意义,不同的酶具有不同Km值，它是酶的一个重要的特征物理常数。Km值只是在固定的底物，一定的温度和pH条件下，一定的缓冲体系中测定的，不同条件下具有不同的Km值。Km值表示酶与底物之间的亲和程度：Km值大表示亲和程度小，酶的催化活性低;Km值小表示亲和程度大,酶的催化活性高。,米氏常数的测定,基本原则：将米氏方程变化成相当于y=ax+b的直线方程，再用作图法求出Km。例：双倒数作图法（Lineweaver-Burk法）米氏方程的双倒数形式：,1 Km 1 1=.+v Vmax S Vmax,1 Km 1 1=+V Vmax S Vmax,取米氏方程式的倒数形式：,1/Vmax,斜率=Km/Vmax,-1/Km,米氏常数Km的测定：,酶的Km在实际应用中的意义,鉴定酶：通过测定Km，可鉴别不同来源或相同来源但在不同发育阶段，不同生理状态下催化相同反应的酶是否是属于同一种酶。判断酶的最适底物。（天然底物）计算一定速度下底物浓度。了解酶的底物在体内具有的浓度水平。判断反应方向或趋势。判断抑制类型。,从米氏方程中求得：当反应速度达到最大反应速度的90%，则,90%V=100%VS/(km+S),即 S=9km,在进行酶活力测定时，通常用4km的底物浓度即可。,计算一定速度下底物浓度,二 pH 的影响,在一定的pH 下,酶具有最大的催化活性,通常称此pH 为最适 pH。,pH,最适pH（optimum pH）,pH稳定性：在一定pH范围内酶是稳定,pH对酶作用的影响机制：1.环境过酸、过碱使酶变性失活；2.影响酶活性基团的解离；3.影响底物的解离。,三 温度的影响,一方面是温度升高,酶促反应速度加快。另一方面,温度升高,酶的高级结构将发生变化或变性，导致酶活性降低甚至丧失。因此大多数酶都有一个最适温度。在最适温度条件下,反应速度最大。,高温两种不同影响：1.温度升高，反应速度加快；2.温度升高，酶热变性速度加快。,最适温度,低温影响：1.温度降低，酶活性降低 2.温度过低,酶无活性但不变性,四 激活剂对酶作用的影响,凡能提高酶活力的物质都是酶的激活剂。如Cl-是唾液淀粉酶的激活剂。,金属离子：K+、Na+、Mg2+、Cu2+、Mn2+、Zn2+、Se3+Co2+、Fe2+阴离子：Cl-、Br有机分子 还原剂：抗坏血酸、半胱氨酸、谷胱甘肽 金属螯合剂：EDTA-这些离子可与酶分子上的氨基酸侧链基团结合，可能是酶活性部位的组成部分，也可能作为辅酶或辅基的一个组成部分起作用,一般情况下，一种激活剂对某种酶是激活剂，而对另一种酶则起抑制作用；对于同一种酶，不同激活剂浓度会产生不同的作用。,应用激活剂时应注意,五 抑制剂对酶活性的影响,使酶的活性降低或丧失的现象，称为酶的抑制作用。能够引起酶的抑制作用的化合物则称为抑制剂。酶的抑制剂一般具备两个方面的特点：a.在化学结构上与被抑制的底物分子或底物的过渡状态相似。b.能够与酶以非共价或共价的方式形成比较稳定的复合体或结合物。,抑制剂类型和特点,竞争性抑制剂可逆抑制剂 非竞争性抑制剂 反竞争性抑制剂,非专一性不可逆抑制剂不可逆抑制剂 专一性不可逆抑制剂,抑制剂与酶的必需基团以共价键结合，引起酶活力丧失，不能用透析、超滤等物理方法除去抑制剂而使酶复活。,（一）不可逆抑制,1、非专一性不可逆抑制剂,抑制剂作用于酶分子中的一类或几类基团，这些基团中包含了必需基团，因而引起酶失活。,类型：,2、专一性不可逆抑制剂,这类抑制剂选择性很强，它只能专一性地与酶活性中心的某些基团不可逆结合，引起酶的活性丧失。,（二）可逆抑制抑制剂与酶蛋白以非共价方式结合，引起酶活性暂时性丧失。抑制剂可以通过透析等方法被除去，并且能部分或全部恢复酶的活性。根椐抑制剂与酶结合的情况，又可以分为三类,1 竟争性抑制,某些抑制剂的化学结构与底物相似，因而能与底物竟争与酶活性中心结合。当抑制剂与活性中心结合后，底物被排斥在反应中心之外，其结果是酶促反应被抑制了。,+I,EI,ES,P+E,E+S,竞争性抑制作用,竞争性抑制作用特点：,1）竞争性抑制剂的结构与底物结构十分相似，二者竞争酶的结合部位。,4）Vmax不变，Km增大,V/2,km,2）抑制程度取决于I和S的浓度以及与酶结合的亲和力大小。,km,无 I,有 I,3）可以通过增大底物浓度，即提高底物的竞争能力来消除。,2 非竟争性抑制,酶可同时与底物及抑制剂结合，引起酶分子构象变化，并导至酶活性下降。抑制剂与活性中心以外的基团结合，不与底物竞争美的活性中心，所以称为非竞争性抑制剂。如某些金属离子（Cu2+、Ag+、Hg2+）以及EDTA等，通常能与酶分子的调控部位中的-SH基团作用，改变酶的空间构象，引起非竞争性抑制。,非竞争性抑制作用,+I,EI+S,ESI,ES,P+E,E+S,+I,实例：重金属离子（Cu2+、Hg2+、Ag+、Pb2+）金属络合剂（EDTA、F-、CN-、N3-）,非竞争性抑制特点：1）、抑制剂与底物结构不相似，抑制剂与酶活性中心以外的基团结合。2）、Vm下降，Km不变3）、非竟争性抑制不能通过增大底物浓度的方法来消除。,非竞争性抑制可用下式表示：,非竞争性抑制作用：底物和抑制剂同时与酶结合，但形成的EIS不能进一步转变为产物。,无 I,V/2,km,有 I,(),3、反竞争性抑制作用酶只有在与底物结合后，才能与抑制剂结合，引起酶活性下降。,ESI,ES,P+E,E+S,+I,反竞争性抑制特点：1）抑制剂与酶和底物的复合物结合。2）Km和Vm下降3）底物浓度增加，抑制作用加强。,反竞争性抑制：,有无抑制剂存在时酶促反应的动力学方程,第六节、酶活力测定,又称为酶活性，一般把酶催化一定化学反应的能力称为酶活力。通常以在一定条件下酶所催化的化学反应速度来表示。因此酶活力可用单位时间内单位体积中底物的减少量或产物的增加量表示，单位为浓度单位时间等。酶是蛋白质，种类多，结构复杂多样，一般对酶的测定，不是直接测定其酶蛋白的浓度，而是测定其催化化学反应的能力，这是基于在最优化条件下，当底物足够（过量），在酶促反应的初始阶段，酶促反应的速度（初速度）与酶的浓度成正比（即V=KE），故酶活力测定的是化学反应速度，一定条件下可代表酶活性分子浓度,一、酶活力,2.酶活力的测定,(1)测一定时间内产物生成量(2)测定完成一定量反应所需时间,测定时确定三种量：加入一定量的酶；一定时间间隔；物质的增减量。,测定酶活力常有以下几种方法：在一个反应体系中，加入一定量的酶液，开始计时反应，经一定时间反应后，终止反应，测定在这一时间间隔内发生的化学反应量（终止时与起始时的浓度差），这时测得的是初速度。在一定条件下，加入一定量底物（规定），再加入合适量的酶液，测定完成该反应（底物反应完）所需的时间，（非初速度，为一平均速度）。动态连续测定法。在反应体系中，加入酶，用仪器连续监测整个酶促反应过程中底物的消耗或产物的生成。快速反应追踪法。近年来，追踪极短时间（10-3s以下）内反应过程的方法和装置已经应用。其代表有停流法（stopped-flow）和温度跃变法（temperature jump）。,酶活力测定方法：反应计时。反应计时必须准确。反应体系必须预热至规定温度后，加入酶液并立即计时。反应到时，要立即灭酶活性，终止反应，并记录终了时间。终止酶反应，常使酶立刻变性，最常用的方法是加入三氯乙酸或过氯酸使酶蛋白沉淀，也可用SDS使酶变性，或迅速加热使酶变性。有些酶可用非变性法来停止反应或用破坏其辅因子来停止反应。反应量的测定。测底物减少量或产物生成量均可。在反应过程中产物是从无到有，变化量明显，极利于测定，所以大都测定产物的生成量。具体物质量的测定，据被测定物质的物理化学性质通过定量分析法测定。常用的方法有：光谱分析法：酶将产物转变为（直接或间接）一个可用分光光度法或荧光光度法测出的化合物。化学法：利用化学反应使产物变成一个可用某种物理方法测出的化合物，然后再反过来算出酶的活性。放射性化学法：用同位素标记的底物，经酶作用后生成含放射性的产物，在一定时间内，生成的放射性产物量与酶活性成正比。,二 酶活力单位：是衡量酶活力大小的计量单位,规定条件（最适条件）下一定时间内催化完成一定化学反应量所需的酶量。据不同情况有几种酶活力单位或又称酶单位。(一）国际单位：1、国际单位U（Unit）：在最佳条件或某一固定条件下每分钟催化生成1mol产物所需要的酶量为一个酶活力单位。,1 U=1mol/min,2、“Katal”单位：指在一定条件下1秒钟内转化1mol底物所需的酶量。1 Kat=1mol/sKat和U的换算关系：1 Kat=6107U，1U=16067n Kat,以上的酶单位定义中，如果底物（S）有一个以上可被作用的化学键，则一个酶单位表示1分钟使1mol有关基团转化的酶量。如果是两个相同的分子参加反应，则每分钟催化2mol底物转化的酶量称为一个酶单位。在“U”和“kat”酶活力单位的定义和应用中，酶催化底物的分子量必须是已知的，否则将无法计算。,比活力（比活性）：每单位（一般是mg）蛋白质中的酶活力单位数（酶单位/mg蛋白）。实际应用中也用每单位制剂中含有的酶活力数表示（如：酶单位/mL（液体制剂），酶单位/g（固体制剂），对同一种酶来讲，比活力愈高则表示酶的纯度越高（含杂质越少），所以比活力是评价酶纯度高低的一个指标。在评价纯化酶的纯化操作中，还有一个概念就是回收率。回收率=某纯化操作后的总活力/某纯化操作前的总活力 总活力=比活力总体积（总重量）,三 比活力,第六节 酶工程简介,一、化学酶工程 天然酶 固定化酶 化学修饰酶 人工模拟酶二、生物酶工程 克隆酶 突变酶 新酶,将酶学和工程学相结合，产生了酶工程(enzyme engineering)这样一个新的领域。酶工程主要研究酶的生产、纯化、固定化技术、酶分子结构的修饰和改造以及在工农业、医药卫生和理论研究等方面的应用。,（一）天然酶的分离纯化,1、基本原则：提取过程中避免酶变性而失去活性；防止强酸、强碱、高温和剧烈搅拌等；要求在低温下操作，加入的化学试剂不使酶变性，操作中加入缓冲溶液.2、基本操作程序：选材：微生物（微生物发酵物:胞内酶，胞外酶），动物（动物器脏：消化酶，血液：SOD酶，尿液：尿激酶等）,植物（木瓜蛋白酶，菠萝蛋白酶等）。抽提：加入提取液提取。胞内酶先要进行细胞破碎（机械研磨，超声波破碎，反复冻融或自溶等），分离：先进行净化处理（过滤，絮凝，离心脱色），再采用沉淀法分离（盐析法，有机溶剂沉淀法，超离心等）。纯化：可采用离子交换层析，凝胶过滤，液相色谱，亲和色谱和超滤等方法。,（二）固定化酶固定化酶是通过吸附、耦联、交联和包埋等物理或化学的方法把酶连接到某种载体上，做成仍具有酶催化活性的水不溶性酶。作用特点：稳定性提高，易分离，可反复使用，提高操作的机械强度。,固定化酶,将水溶性酶用物理或化学方法处理，固定于高分子支持物(或载体)上而成为不溶于水，但仍有酶活性的一种酶制剂形式，称固定化酶(immobilized enzyme)。,共价偶联法,交联法,溴化氰亚氨碳酸基偶联法,OH,OH,BrCN,H2O,O,O,C=N-E,O-CO-NH-E,OH,O-C-NH-E NH,OH,H2N-E,（多羟基载体）,O-CONH2,OH,（惰性）,O,O,C=NH,（活泼）,OC N,OH,戊二醛交联法,H2N-E,（三）化学修饰酶：功能基团的化学修饰酶 酶蛋白侧链的化学修饰 酶分子内或间的交联反应 优点：提高稳定性，增强催化效率,（三）化学修饰酶：,（四）人工模拟酶,酶的模拟：根据酶作用的原理摸拟酶的活性中心和催化机理，用化学方法制备结构较简单,高效、高选择性、稳定性能好的新型催化剂,可以是无机化合物、有机化合物或小肽。,酶模型是人工合成的一类具有酶的某些属性的有机化合物。虽然它的分子比较小，结构比较简单，但是含有酶所具有的主要活性基团以及与酶的活性中心相似的空间结构，能够模拟酶的某些关键性功能。目前研究得比较多的主要是水解酶和单加氧酶模型。,人工模拟酶-benzyme,环糊精,催化侧链,催化侧链连接到环糊精上，可模拟胰凝乳蛋白酶,二 生物酶工程,生物酶工程是以酶学和DNA重组技术为主的现代分子生物学技术相结合的产物，也称高级酶工程。包括：1、用基因工程技术大量生产酶（克隆酶）2、对酶基因进行修饰，产生遗传修饰酶（突变酶）3、设计新酶基因，合成自然界没有的酶（新酶）,生物酶工程示意图,酶的蛋白质结构功能,新酶分子蓝图,选择性修饰方案,突变酶,新酶,克隆酶,产品,效用,发展,酶基因,遗传设计,遗传修饰,DNA重组技术,DNA重组技术,抗体酶,抗体酶（abzyme）又称催化抗体（catalytic antibody）,是指通过一系列化学与生物技术方法制备出的具有催化活性的抗体，它除了具有相应免疫学性质，还类似于酶，能催化某种活化反应。抗体与酶相似，都是蛋白质分子，酶与底物的结合及抗体与抗原的结合都是高度专一性的，但这两种结合的基本区别在于酶与高能的过度态分子结合，而抗体则与抗原（基态分子）相结合。利用抗体能与抗原特异结合的原理可用过度态类似物作为半抗原来诱发抗体，这样产生的抗体便能特异地识别反应过程中真正的过渡分子，从而降低反应的活化能。达到催化反应的目的，这种具有催化功能的抗体就被称为催化抗体或抗体酶。,B.酯的羧基碳原子受到亲核攻击形成四面体过渡态,C.设计的磷酸酯类似物,作为抗原去免疫实验动物,磷酸酯类似物(半抗原),对酯水解反应有催化作用的单克隆抗体,免疫,免疫反应,诱导法制备具有酯酶活性的抗体,基因工程抗体酶的制备,对已产生的单抗，分析氨基酸的组成或相应基因的碱基序列，对抗体结合的部位的基因进行定位突变，在抗体结合部位换上有催化活性的氨基酸，基因工程的技术使得建立抗体基因的组合文库，并根据需要构建适当程序的基因片段成为可能。,抗体酶的筛选,在抗体酶研究中，一个不可少的步骤是在细胞融合后筛选到能分泌催化抗体的细胞克隆。一般的方法是先筛选其抗体能结合特异抗原的细胞克隆，再从纯化的抗体中筛选出有催化能力的单抗。主要筛选方法有生物学筛选法和纯化学筛选法。,抗体酶的研究和应用前景,催化抗体的出现不仅为人们开创了一条人工设计酶的新方法，也使人们对催化过程中催化剂的作用机理和催化剂和底物的相互识别有了进一步认识。目前已经发现具有催化作用的自身抗体在生物体内的存在，其不仅和疾病相关，可能还参与了生物体内的某些或基本的生物学反应。有可能成为抗体酶研究的新热点。充分利用抗体的种类繁多以及抗体酶的可诱导、可改造的特点，可望制备出具有治疗和辅助治疗某些疾病或催化某类具有特殊意义反应的抗体酶。抗体酶的研究无疑会对化学、生物学、医学等领域产生深远影响。,酶的制剂形式：固体：干燥（冰冻升华，喷雾干燥，真空干燥）液体保存：低温下短期保存。2.酶活力的测定概念酶活力：又称为酶活性，一般把酶催化一定化学反应的能力称为酶活力，通常以在一定条件下酶所催化的化学反应速度来表示。基本原理:酶是蛋白质，种类多，结构复杂多样，一般对酶的测定，不是直接测定其酶蛋白的浓度，而是测定其催化化学反应的能力，这是基于在最优化条件下，当底物足够（过量），在酶促反应的初始阶段，酶促反应的速度（初速度）与酶的浓度成正比（即V=KE），故酶活力测定的是化学反应速度，一定条件下可代表酶活性分子浓度。,酶的保存：1.低温（04，-20）；2.高浓度较稳定；3.加入稳定剂；4.固定化。,酶的固定化就是把水溶性酶经物理（吸附法与包埋法）或化学方法（共价偶联法与交联法）处理后，使酶与惰性载体结合或将酶包埋起来成为一种不溶于水的状态。,吸附法：使酶被吸附于惰性固体的表面，或吸附于离子交换剂上。,包埋法：使酶包埋在凝胶的格子中或聚合物半透膜小胶囊中。,偶联法：使酶通过共价键连接于适当的不溶于水的载体上。,交联法：使酶分子依靠双功能基团试剂交联聚合成“网状”结构。,