遗传工程的载体.ppt

遗传工程的载体,随着人们对遗传物质DNA的深入研究，许多科学家尝试直接用DNA转化原核或真核生物但成效甚微，理想重组体分子的发生频率极低。主要的原因是：外源DNA在宿主细胞连续增殖的情况下，由于不能自我复制而丢失，只有少数被整合到质粒或寄主基因上的片段才能幸存下来。,DNA能在寄主细胞中得到复制的一个必要条件就是具备复制起点。细菌和病毒的基因组通常只有一个复制起点。这种能够自我复制，而且仅具有一个复制起点的DNA分子称为复制子(replicon)。大多数DNA片段不是复制子，因而不能自我复制；DNA分子即使包含复制起点，在外源寄主细胞中也不一定有功能。DNA重组技术的优越性在于利用寄主细胞中有复制功能的复制子作载体，连上理想的外源DNA片段，然后被送到寄主细胞中。,载体的功能及特征,通常把能携带外源基因进入受体细胞的运载工具称为基因克隆载体。载体的功能：运送外源基因高效转入受体细胞为外源基因提供复制能力或整合能力为外源基因的扩增或表达提供必要的条件,载体应具备的条件：,1.具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性（可转移性）2.具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点3.具有较高的外源DNA的载装能力,4.具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点(多克隆位点)5.具有合适的筛选标记,质粒载体,质粒（plasmid)是生物细胞内固有的、能独立于寄主染色体而自主复制、并被稳定遗传的一类核酸分子，绝大多数的天然DNA质粒具有共价、封闭、环状的分子结构，也成CCC-DNA。质粒常见于原核细菌和真菌中，绝大多数的质粒是DNA型的；质粒DNA的分子量范围：1-300 kb质粒DNA分子可以持续稳定地处于染色体外地游离状态，但在一定地条件下又会可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体地复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。,环形双链的质粒DNA分子具有三种不同的构型：共价闭合环DNA（SC构型），开环DNA（OC构型），线性DNA（L构型），具有不同的电泳迁移率，可在琼脂糖凝胶电泳中分开。走在最前的是SCDNA其后一次是LDNA和OCDNA。,质粒的复制,质粒是一个独立的复制单元（复制子），带有复制起始点及其相关的复制元件。质粒能利用寄主细胞的DNA复制系统进行自主复制；质粒DNA上的复制子结构决定了质粒与寄主的对应关系。,有自己的复制起点和控制复制频率的调控基因,质粒的自主复制性：拷贝数的控制机制-质粒DNA复制启动控制,ori,rop,（+）,Rop,RNA II,RNA I,3,5,5,3,复制方向,然后在RNA酶H的作用下将RNAII加工为成熟的引物（555个碱基)起始质粒DNA的合成。,在开始复制时，首先由RNA聚合酶在复制起始位点上游550bp处开始合成一条约750个核苷酸的RNA分子（称作RNAII）。,在质粒起始复制的过程中，有一小段RNA分子（称作RNAI)起负调控作用。RNAI是由RNAII基因的反义链编码的，仅108个碱基。,以E.coli ColE1 质粒为例说明质粒复制,这条RNA分子的5端折叠形成一个富含G的环与质粒复制起始位点上游约20个碱基处的富含C的区域配对。,RNAI折叠成三叶草结构，它与RNAII前提结合使后者不能形成特定的二级结构，从而影响了RNAII与DNA形成稳定的杂种分子，是质粒DNA的复制不能正常进行。在细胞中RNAI的半衰期很短，它的浓度是由自由基的剂量（也就是质粒的拷贝数）决定的。如果细胞中的拷贝数高于正常水平，RNAI的含量上升，从而抑制了质粒的DNA的复制。相反，如果细胞中的质粒拷贝数低于正常的水平，RNAI的含量下降，从而促进了质粒DNA的复制。这就是RNAI控制细胞中质粒的拷贝数的方式。,所以根据在每个细胞中的分子数（拷贝数）多寡，质粒可分为两大复制类型：严紧型质粒 1-3 拷贝 stringent plasmid松弛型质粒 10-60 拷贝 stringent plasmid一般来说，构建克隆载体是松弛型质粒。,质粒的不相容性（不亲和性）,当两个质粒带有相同的复制起始位点时，它们在复制和向子细胞的分配中就会产生竞争，如果没有选择，这两个质粒就不能在同一个细胞共存，这种现象被称作质粒的不相容性（incompatibility of plasmid)或质粒的不亲和性（plasmid incompatibility)。以大肠杆菌的质粒为例：ColE1、pMB1拥有相似的复制子结构，彼此不相容pSC101、F、RP4拥有相似的复制子结构，彼此不相容p15A及其衍生质粒拥有相似的复制子结构，彼此不相容,质粒的不相容性：分子机制两种含有不同复制子结构的不同质粒，在复制时各受自己的拷贝数控制系统的调节，致使两种质粒的最终拷贝数恒定，因此在经过若干复制周期和细胞分裂周期后仍能共处于同一细胞内两种含有相似复制子结构的不同质粒，在复制时受到同一种拷贝数控制系统的干扰，致使两种质粒的最终拷贝数不同，其中拷贝数多的质粒在以后的细胞分裂周期中更具优势,质粒的改造,天然质粒是指那些没有经过以基因克隆为目标的体外构建改造的的质粒，往往不能满足分子克隆对载体的需要，只有按预定目标人工构建的质粒才能成为优良的载体。构建一种质粒载体需要考虑以下几个方面：1.质粒载体的分子量（单位bp）应尽可能小。分子量小的质粒作载体有很多有点：如容易从寄主细胞中提取；较能抵抗机械（超声波）切割带来的危害；便于限制性内切酶的酶切和连接等。2.应该了解载体上基因位置、限制性内切酶的作用位点。如果有可能的话，最好还要了解核苷酸序列。,3.在理想寄主中，载体应该容易繁殖，拷贝数多；这样可以得到大量载体和DNA重组分子。4.载体应该包含一个或两个可供选择的标记性状（基因），从而可以区别含有载体的转化细胞和不含有载体的非转化细胞。5.在载体上有多克隆位点，便于质粒的酶切和外源DNA片段的克隆。,右图显示了pBR322质粒上的四环素抗性基因（Tcr或Tetr)和氨苄青霉素抗性基因（Ampr或ampr）和对应的酶切位点。,常用的遗传标记基因及其作用机制 1.四环素抗性基因（Tetr，Tcr）Tetracycline 可结合在核糖体30s亚基中的一种蛋白质分子上，抑制核糖体的转位过程。四环素抗性基因编码一种399 AAs蛋白质，与细菌细胞膜结合，阻止四环素分子进入细菌细胞。2.氨苄青霉素抗性基因（Ampr，Apr）Ampicillin可抑制细菌细胞膜上参与细胞壁合成酶类的活性。Apr抗性基因编码一种分泌到细菌细胞周间质的酶，可特异地切割氨苄青霉素的内酰胺环，使氨苄青霉素失活。,3.氯霉素抗性基因（Cmlr，Cmr）Chlorophenicol可结合在核糖体50 S亚基上，阻止蛋白质合成。Cmr基因编码氯霉素乙酰转移酶，使氯霉素乙酰化，导致乙酰化的氯霉素不能结合在核糖体上。4.卡那霉素(Kanr),新霉素(Neor)和G418抗性(G418r)基因 Kanamycin，Neomycin和G418均属脱氧链霉胺氨基葡萄糖苷类抗生素，可结合在核糖体上阻止蛋白质的合成。Kanr等抗性基因均可使这类抗生素磷酸化，使之不能进入细胞内。,目前常用的质粒载体,1.带有多克隆位点的质粒,多克隆位点是一段人工合成序列，其中含有多个限制性核酸的切割位点，如下图的Puc18fr 的多克隆位点上有十多个限制性内切酶的切点。,2.带有噬菌体启动子的质粒,2743 bp,MCS,PT7,Apr,pGEM-3Z,PSP6,lacZ,ori,许多质粒在多克隆位点附近带有来自噬菌体（T3、T7和SP6等）的启动子。这样在多克隆位点插入的外源DNA就可以在体外得到转录。,右上图的大肠杆菌质粒载体pGEM-3Z的多克隆位点的两边各有一个来自不同噬菌体的启动子，可以在两个不同方向转录插入的DNA片段。,3.表达质粒 表达质粒载体在多克隆位点上的上游有强启动子，使插入的外源基因可以在细胞内转录和翻译成蛋白质。,单链噬菌体克隆载体,M13噬菌体M13是一种丝状的大肠杆菌噬菌体，包含一个单链的环状DNA分子，全长6407个核苷酸；M13噬菌体并不裂解他们的宿主，受侵染的细胞可以继续生长和分解并释放出大量的新生的M13噬菌体；M13噬菌体只有通过细菌外边的性伞毛（蛋白质丝状物）才能将其DNA注入细菌，因此它只侵染有性伞毛的大肠杆菌（细胞内有F因子）。,M13噬菌体感染其宿主的过程：,（+）DNA,RFDNA,RFDNA,-DNA,II,以噬菌体单链DNA即（+）链作为模板，复制一条与（+）链互补的（-）链，形成亲本复制型（RF)的双链M13DNA，然后以这种双链DNA通过复制或其他复制方式形成大量的RF拷贝。,RF NDA的（-）链进行转录，产生病毒mRNAs,病毒基因II产物使RF NDA（+）链上的特定位置产生一个切口。,滚换复制：以（-）链为模板连续地合成后代（+）链,形成的后代（+）链经切割后组装形成M13噬菌体,互补,-半乳糖苷酶（-gal）是大肠杆菌lacZ基因的产物，当培养基中的一种色素原（X-gal）被-gal切割后即产生蓝色。如果大肠杆菌lacZ基因区域（5端）缺失，则只能编码一种在氨基酸端截短的多肽，形成无稳定活性的不完全酶，称为受体。如果M13的lacZ基因在相反的方向缺失，则产生在羧基端截短的多肽，也无半乳糖苷酶的活性，但这种蛋白质可作为供体。受体一旦接受了供体（在体内或体外）即可恢复半乳糖苷酶的活性，这种现象称为互补(complementation),M13及其宿主的构建,对M13的构建：M13上的基因II和基因IV之间存在着非编码区域，因此，引进一部分lac操纵子序列不影响噬菌体的活力。,III VI I IV II X V VII IX VIII,III VI I IV II X V VII IX VIII,lacZ,polylinker,MCS,野生型M13RF-DNA,M13mp系列载体,插入成分包含lac启动子（P)、操纵子（O)、和-gal基因氨基端146个氨基酸的编码序列（Z，即供体肽的编码序列）等。,还使供体肽的编码序列里包含有多种限制性内切酶的识别序列（多克隆位点MCS），这对供体肽的互补能力毫无影响。,对M13寄主的改造：使寄主细胞中仅包含一个有功能的lacZ基因，而且这个基因的区域已被删掉。当改造的M13侵染这种寄主时，由M13产生的供体能够与寄主细胞产生的无活性的-gal（受体）互作形成一种八聚体，从而恢复-半乳糖苷酶的活性。如果培养基中含有X-gal和诱导物IPTG时，凡是包含半乳糖苷酶活性的细胞将转变为蓝色，由于互补作用受侵染的细胞产生蓝色噬菌斑；反之不含有这种酶活性的细胞将保持白色。如果一个外源DNA 片段插入到M13载体的多克隆位点上，阻碍了供体的产生，就观察不到互补现象。,M13 DNA载体的特点：使克隆的DNA片段以特定单链的形式输出受体细胞外，这在DNA定向突变中非常有用；M13重组分子筛选简便；被M13噬菌体感染的受体细胞生长缓慢，形成混浊斑，易于辨认挑选。而且重组分子越大，混浊斑的混浊度亦越大 但M13-DNA载体的最大缺陷是装载量小，只有1.5 kb,噬菌粒,噬菌粒是一类人工构建的含有单链噬菌体包装序列、复制子以及质粒复制子、克隆位点、标记基因的特殊类型的载体。噬菌体载体兼具单链噬菌体和质粒的特点。噬菌粒载体的特点：能像M13-DNA那样体外包装，并高效转染受体细胞；像质粒那样在受体细胞中自主复制，双链DNA稳定，易于大量提取；装载量比常规的M13mp系列要大很多（10 kb），M13mp载体（4 kb）通过克隆双链DNA能获得同等长度的单一单链DNA重组操作简便，筛选容易,双链噬菌体克隆抗体,以大肠杆菌的 噬菌体DNA为例：,噬菌体是大肠杆菌的温和型噬菌体,噬菌体由DNA（NDA)和外壳蛋白组成，结构上分为头部和尾部两部分，NDA集中在头部。,NDA是线状DNA分子全长是48502bp，左右两端各有12个核苷酸组成的5凸出粘性末端，而且二者的核苷酸序列互补，即：,5GGGCGGCGACCTNN.NN3 3NN.NNCCCGCCGCTGGA5,DNA 进入宿主细胞后，粘性末端连接形成环状DNA分子。通常把能互补连接的粘性末端成为cos位点。,噬菌体的基因族结构,cos,头部合成基因,尾部合成基因,溶菌控制基因,晚期控制基因,DNA合成控制基因,阻遏基因,早期控制基因,阻遏基因,重组基因,l-DNA,删除与整合基因,根据噬菌体和宿主的关系，把噬菌体分为温和性噬菌体和烈性噬菌体,某种噬菌体感染宿主细胞后，其DNA与宿主染色体DNA整合，一起复制和传代，无感染其他细胞的能力，这样的噬菌体为温和型噬菌体。带着种噬菌体的宿主细胞称为溶源性细胞。,溶源性细胞,溶源性细胞在一定的诱导因子作用下，噬菌体DNA会脱离染色体DNA重新包装成噬菌体颗粒，释放到宿主外，再去感染其他细胞，此过程被称为溶源性增殖途径。,有些噬菌体感染宿主细胞后，其DNA不插入染色体DNA，经过一定时间的潜伏期，就大量增殖新的颗粒，使宿主细胞破裂，释放出来的噬菌体颗粒又感染其他细胞，把此过程称为溶菌性增殖途径；把这样的噬菌体称为烈性噬菌体。,温和性噬菌体不会导致宿主细胞死亡，并且溶源细胞可以传代，因此温和性噬菌体是构建噬菌体克隆载体很好的材料,噬菌体的侵染,E.coli,吸附,LamB受体,注入,复制,包装,裂解,在大肠杆菌的的表面有一种外膜蛋白麦芽糖孔蛋白（又叫噬菌体受体蛋白）受体，可以促进麦芽糖或麦芽糖糊精从胞外进入细胞。这种蛋白是由大肠杆菌的lamB基因编码的，它的表达受麦芽糖诱导，同时又受葡萄糖抑制。,噬菌体通过位于尾部顶端的J蛋白与麦芽糖孔蛋白受体互作吸附到大肠杆菌表面。当噬菌体尾部的组分与大肠杆菌基因编码的甘露糖磷酸转移酶互作后，噬菌体和受体就形成了一个不可逆的复合体。,噬菌体载体的构建,选用噬菌体作为构建克隆载体材料的依据1.噬菌体是一种温和噬菌体。它对大肠埃希菌具有很高的感染能力，以原噬菌体的形式可长期潜伏在溶源细胞中，容易保存。在一定的条件下又可转入溶菌生长途径，进行大量的增殖。2.能承载比较大的外源DNA片段。野生型噬菌体头部容许包装DNA分子大小为75%-105%的DNA片段，约36.4-51kb，而且DNA上约有20kb的区域对噬菌体的生长不是绝对需要的，可以缺失或被外源DNA片段代替。3.DNA分子上有多种限制性核酸内切酶识别位点，便于多种外源DNA酶切片段的克隆。,构建噬菌体克隆载体的基本策略包括：在DNA上切去部分非必需的区域；抹去多余的限制性核酸内切酶切割位点；插入可供选择的标记基因和建立体外包装系统等1）利用限制性核酸内切酶切去DNA上的非必需区 DNA长达48.5kb，在如此长的DNA分子上，一种限制性核酸内切酶往往有多个识别序列。这些限制性核酸内切酶的识别序列有的在非必需区内，有的在必需区内，某些限制性核酸内切酶切割时，可以切去非必需区，但同时也会切去必需区，使DNA上的某些功能消失。因此对于某种限制性核酸内切酶来说，在构建的克隆载体上只能保留1-2个识别序列作为克隆位点，用于插入或替换外源DNA片段。此外，必须用点突变或甲基化酶处理等方法是必需区内的这种酶的识别序列失效，以避免外源DNA片段插入必需区。,2.在DNA的非必需区内插入选择标记基因 噬菌体只容许包装小于51kb个大于36.4kb的DNA片段，不在这个区间长度片段的重组DNA不能被包装成噬菌体颗粒，而在外包装过程中自然被淘汰。这本身就是一种根据重组DNA分子大小进行筛选的方法。但这种方法不能区别野生型噬菌体与包装了重组DNA分子的噬菌体。野生型的噬菌体不能在P2噬菌体溶源性的细菌中繁殖（Spi+），这种生长抑制表型受DNA上的red和gam两个基因控制。若将外源DNA取代red和gam，重组噬菌体便拥有Spi-表型，能在P2噬菌体溶源性的大肠杆菌受体菌中繁殖，并形成透明斑。这种选择标记同样存在局限性，只能用P2噬菌体溶源性细胞作为受体菌。构建噬菌体克隆载体时，最好是在非必需区内插入新的筛选基因，如大肠埃希菌的lacZ基因。用具有lacZ基因的噬菌体克隆载体转染的受体菌处在含X-gal的培养基上时会出现蓝色的噬菌斑。,3.建立DNA分子体外包装系统 DNA重组分子需在体外人工包装成有感染力的噬菌体重组颗粒，方可高效导入受体细胞；用于体外包装的蛋白质可直接从感染了噬菌体的大肠杆菌中提取，现已商品化。这些包装蛋白通常分为相互互补的两部分：一部分缺少E组份，另一部分则缺少D组份。包装时，当且仅当这两部分包装蛋白与重组DNA分子混合后，包装才能有效进行，任何一种蛋白包装液被重组DNA污染后，均不能被包装成有感染力的噬菌体颗粒，这也是基于安全而设计的。,野生型DNA包装的上限为51kb，本身长度为48.5kb，只有当插入的外源DNA片段不大于2.5kb时，才能被包装成有感染力的噬菌体颗粒。因此缩短野生型DNA的长度，可以提高装载量。其实野生型DNA上约有40-50%的片段是复制和裂解所非必需的。根据切除的多少，可将DNA分成两大类载体：插入型载体 取代型载体（置换性载体）,粘粒载体（考斯质粒）,DNA载体和M13-DNA载体的装载量最大分别为25 kb和1.5 kb，但在很多情况下，往往需要克隆更大的外源DNA片段，考斯质粒和噬菌粒载体的构建就是为了进一步提高噬菌体DNA的装载量。在包装上限固定的条件下，大幅度缩短噬菌体DNA的长度，就能同步增加载体的装载能力。将噬菌体DNA与包装有关的序列与质粒组装在一起，既能最大限度地缩短载体的长度，同时又能保证重组DNA分子在体外仍被包装成有感染力的颗粒，这便是构建考斯质粒和噬菌粒载体的思路。当然，由于考斯质粒和噬菌粒不再携带包装蛋白基因，因此重组DNA分子在细胞内不能形成噬菌体颗粒。,粘粒载体（考斯质粒）,考斯质粒（也叫粘粒）（cosmid）是一类由人工构建的含有噬菌体DNA的cos序列和质粒复制子的特殊类型的质粒载体。comid是cos site carrying plasmid的缩写，原意为带有粘性末端位点的（cos）质粒。,pHC79,6400 bp,Tcr,ori,Apr,PstI,BamHI,SalI,cos,DNA,四环素抗性基因,氨苄青霉素抗性基因,右图考斯质粒载体pHC79的结构:来自pBR322的部分是一个完整的复制子，编码一个复制起点和两个抗生素抗性基因Apr和Tcr。来自DNA部分的片段除了提供cos位点外，在cos的两侧还具有与噬菌体包装有关的DNA短序列，这样就能够包装成有感染性的噬菌体颗粒。,pHC79考斯质粒兼备了噬菌体载体和pBR322质粒载体的两方面的优点其克隆能力为31-45kb,构建的考斯质粒载体（cosmid vector)是一种环形双链DNA分子，大小为4-6kb。他由三部分组成：具有抗性标记和一个质粒的复制起始部位；一个或多个限制酶的单一切割位点；一个带有噬菌体的粘性末端片段。考斯质粒载体的特点：能像DNA那样进行体外包装，并高效转染受 体细胞；能像质粒那样在受体细胞中自主复制；重组操作简便，筛选容易；装载量大（45 kb）且克隆片段具有一定的大 小范围；不能体内包装，不裂解受体细胞,本章节参考书：1.遗传工程概论（第2版），中国农业大学出版社，2005年，谢友菊、王国英、林爱星 编著2.基因工程 科学出版社（高等师范院校新世纪教材）2005年，刘祥林、聂刘旺 主编3.基因工程 科学出版社（21世纪高等院校教材）2006年，楼士林、杨盛昌、龙敏男、章军 编著,Thank you!,