酶工程2酶的发酵生产.ppt

第二章 酶的发酵生产,酶的发酵生产,第一节 酶生物合成的基本理论第二节 酶发酵生产常用的微生物第三节 发酵工艺条件及控制第四节 酶发酵动力学第五节 动植物细胞培养生产酶,第一节 酶生物合成的基本理论,一、RNA的生物合成转录二、蛋白质的生物合成翻译三、酶生物合成的调节,一、RNA的生物合成转录,转录是以DNA为模板，以核苷三磷酸为底物，在RNA聚合酶（转录酶）的作用下，生成RNA的过程。转录速度表达式?,二、蛋白质的生物合成翻译,翻译：以mRNA为模板，以氨基酸为底物，在核糖体上通过各种tRNA，酶和辅助因子的作用，合成多肽的过程。四个阶段1、氨基酸活化生成氨酰tRNA2、肽链合成的起始3、肽链的延伸4、肽链合成的终止思考:密码子偏爱性与翻译速率?,第二节 酶发酵生产常用的微生物（酶的生产菌种）,一、产酶菌种的要求二、常用的产酶微生物三、利用微生物产酶的优点四、高纯菌种的获取,一、产酶菌种的要求,1、发酵周期短，产量高；2、容易培养和管理；3、产酶稳定性好，不易变异退化，不易被感染；4、有利于酶的分离和纯化；5、安全性可靠，非致病菌。,二、常用的产酶微生物,1、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)2、大肠杆菌(Escherichia coli)3、黑曲霉(Aspergillus niger)4、米曲霉(Aspergillus oryzae)5、青霉(Penicillium)6、木霉(Trichoderma)7、根霉(Rhizopus)8、毛霉(Mucor)9、链霉菌(Streptomyces)10、啤酒酵母(Saccharomyces Cerevisiae)11、假丝酵母(Candida),微生物发酵法,微生物,酶,微生物种类繁多，制备出的酶种类齐全，几乎所有的酶都能从微生物中得到,微生物繁殖快、生产周期短、培养简便，并可以通过控制培养条件来提高酶的产量,微生物具有较强的适应性和应变能力，可以通过适应、诱导、诱变以及基因工程等方法培育出新的产酶高的菌株,优点,商品酶的主要生产方法,微生物发酵法,高产优良菌株,培养和繁殖,代谢和积累,分离和纯化,酶制剂,酶的发酵技术,微生物发酵法,产酶微生物,菌种保藏机构,自然界,研究或生产机构,温泉,森林,深海,火山,土壤,产酶微生物的来源,国外菌种保藏机构,ATCC(American Type Culture Collection）美国典型菌种保藏中心NRRL(Agricultural Research Service Culture Collection)美国农业研究菌种保藏中心 DSMZ(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH)德国微生物菌种保藏中心NBRC(NITE Biological Resource Center)日本技术评价研究所生物资源中心,ATCC,ATCC(American Type Culture Collection）美国典型菌种保藏中心ATCC 主要从事农业、遗传学、应用微生物、免疫学、细胞生物学、工业微生物学、菌种保藏方法、医学微生物学、分子生物学、植物病理学、普通微生物学、分类学、食品科学等的研究。该中心保藏有藻类111株，细菌和放线菌16865株，细胞和杂合细胞4300株，丝状真菌和酵母46000株，植物组织79株，种子600株，原生动物1800株，动物病毒、衣原体和病原体2189株，植物病毒1563种。,NRRL,Agricultural Research Service(ARS)Culture Collection原为Northern Regional Research LaboratoryNRRL是由美国农业部农业研究中心支持的政府性质的菌种保藏中心。主要从事农业、应用微生物、基因工程、工业微生物、菌种保藏方法、环境保护、分子生物学、食品安全、普通微生物、分类学的研究。该中心保藏有细菌10500株，真菌45000株，酵母14500株，放线菌9500株。,DSMZ,DSMZ(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH)德国微生物菌种保藏中心DSMZ成立于1969年，是德国的国家菌种保藏中心。该中心一直致力于细菌、真菌、质粒、抗菌素、人体和动物细胞、植物病毒等的分类、鉴定和保藏工作。该中心是欧洲规模最大的生物资源中心，保藏有细菌9400株，真菌2400株，酵母500株，质粒300株，动物细胞500株，植物细胞500株，植物病毒600株，细菌病毒90株等。,NBRC,NBRC(NITE Biological Resource Center)日本技术评价研究所生物资源中心NBRC是由日本经济部、商业部、工业部支持的半政府性质菌种保藏中心。原为IFO(Institute for Fermentation,Osaka,大阪发酵研究所)。主要从事农业、应用微生物、菌种保藏方法、环境保护、工业微生物、普通微生物、分子生物学等的研究。该中心保藏有细菌1446株，真菌568株，酵母164株。这些菌种主要来自本国的其它菌种保藏中心。,国内菌种保藏机构,ACCC 中国农业微生物菌种保藏管理中心CGMCC 普通微生物菌种保藏管理中心AS中国科学院微生物研究所CICC 工业微生物菌种保藏管理中心IFFI轻工业部食品发酵工业科学研究所,微生物发酵法,微生物的筛选,粗筛,菌种分离,含菌样品采集,产酶性能,微生物,优良微生物,诱变,基因工程,其它方法,微生物发酵法,酶的生产过程,培养基,发酵方法,发酵控制,通气供氧,分离纯化,精制,微生物发酵法,酶的发酵生产方式,固体发酵,液体深层发酵,固体发酵,表面培养或曲式培养,以麸皮、米糠等为基本原料，加入适量的无机盐和水作为培养基进行产酶微生物菌种培养的一种培养技术,浅盘培养,转鼓培养,多用通风式厚层培养,固体发酵技术原理,微生物发酵法,微生物发酵法,固体发酵法,设备简单，便于推广，特别适合于霉菌的培养和产酶,发酵条件不易控制、物料利用不完全、劳动强度大、容易染菌等,优点,缺点,不适于胞内酶的生产,液体深层发酵,浸没式发酵,利用液体培养基，在发酵罐内进行的一种搅拌通气培养方式,液体发酵技术原理,酶制剂生产的主要培养方式,原料的利用率和酶的产量都较高，培养条件容易控制,微生物发酵法,常用的酶制剂-1,常用的酶制剂-2,酶的生物合成,酶的生物合成受基因和代谢物的双重控制,生产工艺-工艺流程-胞外,生产工艺-工艺流程-胞内,生产工艺 培养基,生长因子 酶生产时需要供给微生物生长所需的氨基酸、维生素、嘌呤碱和嘧啶碱等生长因子。一般通过加入玉米浆、酵母膏、麸皮、米糠，以及豆饼等来提供。例如：添加含有生长因子的大豆酒精提取物，可使米曲酶的蛋白酶产量提高1.9倍。,产酶促进剂 少量加入之后能显著增加酶产量的物质。一般都是酶的诱导物或表面活性剂。例如纤维素能诱导纤维素酶，吐温80可提高多种酶的产量。表面活性剂提高酶产量的作用机制目前还未完全了解，使用时必须考虑其对微生物是否有毒性。生产上提高胞外酶的活力，一般都采用非离子表面活性剂。,碳源、氮源、无机盐,生产工艺 工艺控制,pH值的影响及控制 酶生产的合适pH 通常和酶反应的最适pH值相接近。生成碱性蛋白酶的芽孢杆菌宜在碱性环境下培养；生产酸性蛋白酶的青霉和根霉应在酸性环境下培养。,温度控制 为了有利于菌体生长和酶的合成，可进行变温生产。例如枯草杆菌AS1.398进行中性蛋白酶生产时，培养温度从31oC逐渐升温至40oC，然后再降温至31oC进行培养，产量提高66%。重组E.coli一般先37C培养，加诱导剂后28C产酶。,生产工艺 工艺控制,生长期与产酶的关系 微生物生长期与产酶有一定的关系，因菌种而异常。如曲霉的蛋白酶当菌体生长进入对数生长期时大量分泌；芽孢杆菌的碱性蛋白酶在对数生长期末大量形成芽孢时才生成。,通气搅拌的影响 酶生产所用的菌种一般都是需氧微生物，培养时都需要通气搅拌。一般，通气量少对霉菌的孢子萌发和菌丝生长有利，对酶生产不利。因此必须根据不同的需要控制不同时期的通气量。,生产工艺 提取,发酵液预处理,酶的沉淀或吸附（盐析法、有机溶剂沉淀法或白土或活性氧化铝吸附）,干 燥（收集沉淀进行干燥磨粉，加入适当的稳定剂、填充剂等制成酶制剂；或在酶液中直接加入适当的稳定剂、填充剂，直接进行喷雾干燥）,酶的提取：,酶制剂产品,液体酶,固体酶,生产工艺造粒,酶粒是在大型连续运转的水平混合机内生产出来的。提取的酶与盐、纤维素及其他成分混合形成0.5mm大小的粒状物。然后用一种聚合体包裹，以防止酶尘在使用过程中可能引起的致敏危险。造粒对顾客及包含酶的最终产品来说，都是一种非常有效和安全的运输固态酶的方式。,用多聚体包裹酶以减少酶尘引起的致敏危险。,生产工艺生产废渣处理,生产废渣实际上是有益于环境的。可被用做当地农田的肥料。确保所有的微生物均经灭活之后才能从生产车间中运出。将含硅藻土、培养基和微生物的发酵液经加热及用碳酸钙进行处理。处理后的发酵液废渣最终为可持续性工业解决方案做出了贡献。,即使是生产废渣也是有用的；它们可以用作肥料。,将生产废渣用做肥料,生产工艺-中性蛋白酶工艺流程,提高酶产量的方法,酶合成的调节机制：在正常情况下，酶产量受酶合成调节机制的控制，要提高酶产量必须打破这种调节控制。酶合成主要取决于转录水平的调节，原核生物中普遍公认的调节机制是操纵子理论。,打破酶合成调节限制的方法：,1、通过条件控制提高酶产量：添加诱导物 降低阻遏物浓度2、通过基因突变提高酶产量：使诱导型变为组成型，使阻遏型变为去阻遏型3、其它提高酶产量的方法：添加表面活性剂 添加产酶促进剂,第四节 酶发酵动力学,发酵动力学：主要研究在发酵过程中细胞生长速率，产物形成速率以及环境因素对速率的影响；在酶的发酵生产中,研究酶发酵动力学对于了解酶生物合成模式；发酵条件的优化控制,提高酶产量具有重要的理论指导意义。酶生物合成模式：根据酶的合成与细胞生长的关系，可以把酶生物合成模式分为4种类型：同步合成型，延续合成型，中期合成型和滞后合成型。,同步合成型：又称生长偶联型,是指酶合成与细胞生长同步进行，当细胞生长进入对数期时，酶也大量合成；当细胞进入稳定期时,酶的合成也停止。延续合成型：酶的合成伴随着细胞生长而开始，但在细胞生长进入稳定期后,酶的合成仍将延续较长一段时间。中期合成型：酶的合成在细胞生长一段时间后才开始，而在细胞生长进入稳定期后,酶的合成也终止。滞后合成型：只有当细胞生长进入稳定期后才开始酶的合成并大量积累。,浓度,时间(h),细胞浓度,酶浓度,细胞浓度,酶浓度,酶浓度,酶浓度,细胞浓度,细胞浓度,A.同步合成型;B.延续合成型;C.中期合成型;D.滞后合成型,A,B,C,D,酶生物合成模式,影响酶生物合成模式的因素主要是mRNA和培养基中存在的阻遏物：mRNA稳定性高的，可以在细胞停止生长后继续合成相应的酶；mRNA稳定性差的，随着细胞生长停止而终止酶的合成；不受阻遏物阻遏的,可随着细胞生长而开始酶的合成；受阻遏物阻遏的,要在细胞生长一段时间或进入稳定期后解除阻遏,才能开始酶的合成。,在酶的工业生产中，为了提高酶产率和缩短发酵周期,最理想的酶合成模式是延续合成型；对于其它类型的酶,要在菌种选育和工艺条件上加以调节；对于同步合成型，尽量提高mRNA的稳定性，如降低发酵温度;对于滞后合成型,尽量减少阻遏物；对于中期合成型，要从提高mRNA稳定性和解除阻遏两方面进行。,第五节 动植物细胞培养生产酶,利用动植物细胞培养生产各种天然物质，是生物工程的一个新领域，20世纪80年代以来，利用植物细胞培养生产的有用产物已达100多种，其中酶制剂有10多种。包括糖苷酶(胡萝卜细胞，1981)，过氧化物酶(甜菜细胞，1983；大豆细胞，1989)等。呈现出良好的发展前景.,一、动植物细胞的特点:,1、体积比微生物大；2、对剪切力敏感；3、生长和代谢速率低，生长倍增时间和发 酵周期长；4、动物细胞营养要求复杂；5、发酵产物不同,二、植物细胞培养和发酵,1、植物细胞发酵技术和特点：发酵特点（与直接提取分离相比较而言）：（1）提高产率；（2）缩短周期;（3）易于管理、减轻劳动强度；（4）提高质量。,2、植物细胞发酵技术(I)高产细胞系的选择：主要有以下几个途径：材料选择，克隆选择，抗性选择，诱变选择,细胞工程和基因工程选择；(II)影响产物产量的因素：材料来源,培养基成分，光照和温度，pH，细胞形态分化程度等;(III)提高产物产量的途径：选择高产细胞系，控制细胞生长和分化程度，加入诱导物或前体，两相培养和产物释放，毛状根培养技术。(IV)植物细胞培养系统专用的生物反应器。,3、植物细胞发酵产酶的工艺条件控制（1）植物细胞生长和发酵所使用的培养基：大量无机盐、维生素和植物激素、无机氮源、碳源（蔗糖）,如MS培养基和B5培养基（2）温度和pH值（3）通风与搅拌（4）前提的添加（5）刺激剂的应用,三、动物细胞发酵,1、动物细胞可以生产多种具有较高价值的药物，特 别是疫苗、激素、单克隆抗体和酶等。由动物细胞培养生产的酶有胶原酶，血纤蛋白溶酶原活性剂等。2、动物细胞培养方法：悬浮培养；固定化细胞培养3、动物细胞发酵工艺条件的控制,作业题：简述一种酶制剂的开发过程！,1.名词解释：酶的发酵生产、固定化细胞发酵、发酵动力学2.酶发酵生产的方式有哪些？（根据细胞培养方式的不同）3.酶发酵生产常用的微生物有哪些？简介产酶性质。4.简述发酵工艺条件是如何调节控制的。5.提高酶产量的措施有哪些？6.酶生物合成的模式有哪些？7.简述固定化细胞发酵产酶的特点及其工艺条件的控制。8.简述植物细胞发酵技术及其产酶工艺条件的控制。9.动物细胞培养和发酵所得动物功能蛋白有哪些？,