实验凝胶过滤法使蛋白质脱盐.ppt

实验三 凝胶过滤法使蛋白质脱盐,山东师范大学生命科学学院,生物化学实验之,【实验原理】凝胶层析又称分子筛层析、排阻层析或凝胶过滤，是以凝胶为载体，根据蛋白质的大小和形状，即蛋白质的相对分子质量进行分离和纯化。该方法广泛用于生物大分子的分离、纯化、浓缩等。,【实验目的】学习凝胶过滤法分离纯化蛋白质的原理与操作技术,凝胶是一类具有多孔立体网状结构的不溶性珠状颗粒。多是交联的聚糖(如葡聚糖或琼脂糖)类物质，用它来进行物质分离，主要是根据多孔凝胶对不同相对分子质量的物质具有不同的排阻效应实现的。,葡聚糖凝胶的商品名称为Sephadex，它具有三维空间的多孔网状结构，呈珠状颗粒。,本实验用G-25使蛋白质与(NH4)2SO4分离，当蛋白质的盐溶液进入葡聚糖凝胶时，小分子的(NH4)2SO4扩散进入G-25的网孔中，而大分子的蛋白质因颗粒直径大，不能进入网孔中，被排阻在凝胶颗粒的外面。加入洗脱液洗脱时，因大分子的蛋白质从凝胶颗粒的间隙随洗脱液向下流动，首先被洗脱下来，而小分子的(NH4)2SO4可以扩散进出凝胶颗粒的网孔之中，随洗脱液移动时受到阻滞力较大，在层析柱中移动较慢，这样蛋白质与(NH4)2SO4很容易地分离开，从而达到对蛋白质样品脱盐的目的。,凝胶过滤层析过程示意图,【器材与试剂】,（一）器材 1.层析柱(15mm300mm）2.铁架台 3.滴定管夹 4.SephadexG25 5.刻度吸管,（二）试剂 1.样品溶液 蛋白质硫酸铵溶液 2.10黄柳酸 3.钠氏试剂 4.洗脱液（去离子水）,【实验操作】（一）凝胶的溶胀 取Sephadex G25，加入去离子水置室温溶胀 24小时以上，反复倾泻去掉细颗粒，或沸水浴中煮沸23小时，可去除颗粒内部的空气及灭菌。,（二）连接层析装置 1.先将层析柱垂直固定在铁架台上。2.按下图将各部位连接起来。,洗脱液,连接软管,层析柱,收集容器,连接软管,（三）装柱与层析 1.装柱 向层析柱中注入少量洗脱液（去离子水），将凝胶浆液沿玻棒缓慢倾入柱中（注满）。凝胶自然沉积约12cm 高度后打开下端出水口,待凝胶床面上升到约3/4柱高停止。关闭出水口,静置。,。,2.洗柱 通过细乳胶管小心地将烧杯中的洗脱液与层析柱接通，然后拧松螺旋夹，让洗脱液滴下冲洗层析柱，以除杂质并使柱床均匀密实（此步也称作平衡）。适当时间后（流下的洗脱液体积一般为柱床体积的23倍），再拧紧螺旋夹。洗柱过程中注意调整流速约2ml/min。,3.加样与洗脱 用刻度吸管吸取1ml样品（蛋白质硫酸铵溶液），其尖头小心沿层析柱内壁伸到床面之上，慢慢将样品加到凝胶床面上（不可搅动床面），此时能看到床面上样品与洗脱液之间有一清晰界面。拧松螺旋夹，待样品全部进入凝胶柱中,接通洗脱液，开始洗脱并收集洗出液。,用刻度离心管收集洗出液，每管收集1ml。边收集边进行蛋白质与铵盐的检查。（1）取洗出液2滴加入白瓷板穴中，加入钠氏试剂1滴，如有铵盐洗脱下来，则有黄红色沉淀。（2）取洗出液2滴置小试管中，加入磺柳酸1滴，如有蛋白质洗脱下来，则有白色混浊或沉淀出现。,4.收集检查,1）NH4+检查 2）蛋白质检查,