色谱的定性与定量.ppt
第四章 色谱的定性和定量方法,一、色谱的定性分析,1、利用保留值定性 鉴别每个色谱峰通过比较保留值(通常是保留时间)的方法，找到各色谱峰所对应的组份大多数情况下用比较保留时间来定性即所谓：保留时间相同，可能是同样的组份保留时间不同，肯定不是同样的组份,（1）气相色谱中用保留值定性的方法,利用已知物直接对照进行定性分析 通常做法：把未知物和已知标准物在同一根色谱柱上，用相同的色谱操作条件进行分析，记录色谱图后利用保留时间进行比对 为避免载气流速和温度变化引起保留时间的变化，可用相对保留值定性或用已知物增加峰高法定性,已知物增加峰高法定性原理：在得到未知样品的色谱图后，往未知样品中加入一定量的已知物质，在同样色谱条件下的两色谱图对比图谱比较峰高。,利用相对保留值定性,定义：相对保留值是组分i与基准物S的调整保留值之比：优点：可以消除某些操作条件的影响，只要柱温、固定相不变，即使柱径、柱长、填充情况及流动相的流速有所变化，相对保留值仍然不变，它是色谱定性分析的重要参数,利用保留指数定性 表示物质在固定液上的保留行为，是目前使用最广泛并被国际上所公认的定性参数，它具有定性可靠，重现性好，标准统一等优点。可将储存在计算机中的标准保留指数转换成用户色谱条件下的保留指数和保留时间（tR）,（A）定义（B）保留指数的测定 保留指数的准确度和重现性都很好，用同一色谱柱测定误差小于1%，因此只要柱温和固定液相同，就可以用文献上发表的保留指数定性。,（2）液相色谱中用保留值定性的方法,保留值定性的主要方法 直接与已知标准物对照 某一未知峰和已知标准物的保留值完全相 同可能是 改变色谱柱或流动相，保留时间仍完全相同基本是,利用文献的数据进行对比和定性分析 注意HPLC的柱填充技术的复杂性，定性受到限制,最简单的方法：标准添加法 前提：要有标准物 判断的标准：加入标准样后，使未知样色谱峰增高，改变色谱条件，未知峰仍能增高,同时用其他方法其他色谱方法（改变机理，如：用不同的色谱柱）其他检测器PDA，光谱图比较、谱库检索 确认色谱峰的纯度-保证每个色谱峰下只有一个被测的组份-检查是否有共流出的物质（杂质）干扰 色谱峰纯度确认的方法-用光电二极管矩阵检测器比较光谱图-峰纯度鉴定，四波长比例MS，质谱图解析、谱库检索其他仪器方法,（3）平面色谱中用保留值定性的方法,定性方法：比较未知组分和已知标准物质的比移值影响比移值的因素：固定相的性质、展开剂的性质、被分离组分的性质、展开时的温度等注意事项 展开槽应密闭 沿分离轨迹固定相与流动相无梯度变化 展开剂的前沿位置能正确测定,2.联机定性,联机定性是指把色谱和质谱、红外、紫外和核磁共振法联合使用联用方式：第一种：先收集色谱分离后的组分，再用“四大谱”的方法进行定性分析第二种：通过“接口”技术直接把色谱和“四大谱”仪器连接起来，对每一被分离的组分进行定性分析,二、色谱定量分析,定量分析的具体内容确定样品的类型，主要成分/痕量成分使分析条件的分离度（R）大于：1.5色谱峰的定性，峰一致性测定检测限及定量限：确定灵敏度及线性范围用标样建立标准曲线检查方法的准确度及精确度用标样定期检查方法,（一）定量分析基础,1.定量分析的基本公式 定量分析的目的：要确定样品中某一组分的准确含量，是一种相对的定量方法 定量分析的方法：在某些限定条件下，检测器响应值（色谱峰的峰面积或峰高）-所测组分的数量或浓度成正比，,即：式中：组分i的质量 组分i的浓度 组分的校正因子（与检测器的性质和被测组分的性质有关）组分i的峰面积，组分i的峰高,2.峰面积的准确测定,1）对称峰的峰高和峰面积的测定第一法：峰高半高 峰宽式中：h从峰顶到峰底线的垂直距离 W h/2峰高1/2处的峰宽,第二法：三角形法式中：BM三角形的高 Wi三角形KML的半高宽，近似等于色谱峰高0.607处的峰宽,2)不对称峰峰高和峰面积的测量第一法：峰高峰宽的平均值式中：h峰顶到峰底线的垂直距离（b0.15+b0.85)峰高0.15处和峰高0.85处的峰宽平均值,第二法：峰分割计算后加和法 A=A1+A2=h1b1+h2b2第三法：大峰上的小峰峰面积的测量第四法：基线漂移时色谱峰峰面积的测量第五法：重叠峰峰面积的测量,3.定量校正因子的测定,（1）绝对校正因子（fi)fi的物理意义:单位峰面积所代表的I组分的量,是一个与i组分的物理化学性质和检测器的性质有关的常数定量校正 因子的计算公式为：注意:峰高定量校正因子fi(h)受操作条件影响较大,绝对校正因子fi的大小主要由操作条件和仪器的灵敏度所决定，既不容易准确测量，也无统一标准；当操作条件波动时，fi也发生变化。故fi无法直接应用，定量分析时，一般采用相对校正因子。,（2）相对校正因子（校正因子）：式中：f-相对校正因子，简称为校正因子，无因次量 fi,fsi 物质、基准物质（s）的质量（或浓度)Ai(hi),As(hs)-物质、基准物质的峰面积（或峰高）,根据物质量的不同表示方法，校正因子分为：,质量校正因子(fm)定义：当物质量用质量来表示时的校正因子称为质量校正因子(fm),表示单位峰面积所代表的组分质量，质量一般用 g 或 mg 表示.式中：mi,ms-被测物质、基准物质的质量 Ai,As-被测物质、基准物质的峰面积,摩尔校正因子(fM)定义：物质的量用摩尔数表示，表示单位峰面积所代表的组分摩尔数 式中：Mi,Ms-被测物质、基准物质的摩尔质量,体积校正因子（fv）定义：物质的量用体积表示,表示单位峰面积所代表的组分体积。式中：Vi,Vs表示被测物质、基准物质的体积,(3)相对响应值s 相对响应值是物质i与标准物质S的响应值（灵敏度）之比。单位相同时，与校正因子互为倒数，即：与只与试样、标准物质以及检测器类型有关，而与操作条件和柱温、载气流速、固定液性质等无关，是一个能通用的常数。,（4）校正因子的实验测量方法,样品的准备：测定校正因子时，要精密称定适量色谱纯的被测组分和基准物质，配制成已知准确浓度的样品。样品的测定：在已确定的色谱条件下，取准确体积的样品进样，从谱图上获得准确的峰面积 计算：根据相对校正因子的计算公式可以算出质量（或摩尔或体积）校正因子,例：某试样合有5g乙醇，测得相应的色谱峰面积为150mm2，求乙醇的fi。解：,即每平方毫米色谱峰面积代表3.310-2g乙醇,例：准确称取一定质量的色谱纯对二甲苯、甲苯、苯及仲丁醇，混合后稀释，采用氢焰检测器，定量进样并测量各物质所对应的峰面积，数据如下：物质 苯 仲丁醇 甲苯 对二甲苯 m/g 0.4720 0.6325 0.8149 0.4547 A/cm2 2.60 3.40 4.10 2.20以仲丁醇为标准，计算各物质的相对质量校正因子。,（二）定量方法,1.归一化法 定义：把所有出峰的组分含量之和按100%计的定量方法称为归一化法，是一种相对定量方法。前提：样品中的所有组分都能流出色谱柱，而且在检测器上所有的组分都能产生信号。计算方法：,优点：归一化法很直观，容易接受，计算简便、准确，当操作条件如进样量、流速等发生变化时，对计算结果的影响很小，是一种常用的计算方法缺点：校正因子的测定比较麻烦，必需所有组分都出峰注意：主要用于GC的定量测定，当 fi相近时，可直接用峰面积归一化法。由于检测技术的影响,HPLC中很少使用归一化,2、内标法,内标法：选择适宜的物质作为待测组分的参比物，定量加到样品中去，根据待测组分和参比物在检测器上的响应值之比和参比物加入量进行定量分析的方法。,键：选择合适的内标物,内标物的选择原则：A、内标物必须是原样品中不存在的物质，其性质尽量与待测组分相近(同系物、异构体)B、内标物不能和被测组分起化学反应，要能完全溶于被测样品中；C、内标物的峰尽可能接近待测组分的峰，或位于几个待测组分的中间，但必须和样品中的所有峰完全分离；D、内标物的加入量应和待测组分相近。,待测组分(i)的量mi为：,设样品的总量为m，则待测组分i的质量分数为,内标法的特点：,无归一化法的限制，即只要被测组分能出峰，不和其他峰重叠，不管其他组分是否出峰或是否重叠，都可以用内标法进行定量分析 定量准确，受操作条件影响较小 可部分补偿待测组分在样品前处理时的损失 若加入几种内标物，还可提高定量分析的精度 内标物的选择比较困难，同时内标物称量要求准确，操作麻烦,内标标准曲线法,如果每次称取同样量(m)的试样，每次加入相等量(ms)的内标物，则上式中m，ms，fi均为常数，计算公式可写为：,从内标公式可知,实际色谱图,例:取二甲苯生产母液1500mg，母液中合有乙苯、对二甲苯、邻二甲苯、间二甲苯及溶剂和少量苯甲酸，其中苯甲酸不能出峰。以150mg壬烷作内标物，测得有关数据如下：物质 壬烷 乙苯 对二甲苯 间二甲苯 邻二甲苯Ai/cm2 98 70 95 120 80 fm 1.02 0.97 1.00 0.96 0.98求:各组分的含量。,解：母液中苯甲酸不能出峰，所以只能用内标法计算。由各组分的绝对校正因子计算得壬烷、乙苯、对二甲苯、间二甲苯、邻二甲苯的相对校正因子分别为1.00，0.95，0.98，0.94，0.96。根据内标法计算公式，对于乙苯有：,同样可以计算出对二甲苯、间二甲苯、邻二甲苯的质量分数分别为9.5%，11.5%，7.84%。,3、外标法 外标法又可分为标准曲线法和外标一点法，是色谱定量分析中比较常用的一种方法，是绝对定量方法。,计算方法：用浓度峰面积（峰高）绘制标准工作曲线，其斜率即为绝对校正因子，应该是一条通过原点的直线。,特点：简便、快速、适合于大量样品的分析无需各组份都被检出、洗脱需要标样标样及样品测定的条件要一致进样体积要准确，重复性好对样品前处理过程中待测组分的变化无法补偿。,外标一点法,利用待测组分纯物质配制一个与待测组分含量相近的标准样（设量为ms），在同一色谱条件下，分别将相同量的待测组分标样及试样注入色谱仪，出峰后，测量其峰面积（或峰高），得相应的峰面积As和Ai,4.标准加入法,是一种特殊的内标法 把待测组分的纯物质作为内标物加入到待测样品在相同的色谱条件下，测定加入待测组分纯物质前、后待测组分的峰面积（或峰高）计算出待测组分在样品中的含量。,具体做法：第一步：在确定的色谱条件下，测定样品中待测组分(i)的峰面积或峰高，Ai(hi);第二步：在第一步所用样品中准确加入已知量为Wi的待测组分(i)，同样条件下测出峰面积或峰高，Ai(hi)；第三步：根据定量基本公式 Wi=fiAi(hi)计算,Wi=fiAi(hi)（前）Wi+Wi=fi Ai(hi)（后）fi和fi是同一组分在加入纯物质前、后两次测定的绝对校正因子,所以有 fi=fi Wi原样品中待测组分(i)的量,标准加入法的特点,不需另外的标准物质做内标，仅需有待测组分的纯物质 进样量的准确性影响不大，操作简单 若在样品前处理之前就加入已知准确量的待测组分，则可完全补偿待测组分在前处理过程中的损失 要求加入待测组分前后两次色谱测定的色谱条件完全相同，才能保证两次测定时的校正因子完全相等,
