细胞活体染色技术.ppt

细胞活体染色技术,2,实验目的,学习细胞活体染色的方法。观察动、植物活细胞内线粒体，液泡系的形态、数量与分布。,3,细胞膜结构,4,实验原理,一般的生物材料不能穿透细胞膜，只有当细胞被固定后，细胞膜被破坏，染料才能进入细胞内部。但是，有一些染料（称“活体染料”）却能进入活细胞，它们是一些无毒或毒性很小的染色剂，能使细胞中某些特定结构着色。活体染料基本上不影响或很少影响细胞的生命活动。,5,活染法弥补了活观察法不能显示细胞精细结构的不足，也避免了固定染色法对细胞结构的破环和造成人为假象的弊病。遗憾的是，适宜活体染色的染料较少，能显示出的结构和种类也不多。活体染色分为体内活染和体外活染两种。前者是将染料注射于生物体内，染色后再取材观察。后者是取材后，对离体的活细胞进行染色。为保持离体细胞的正常存活，染色时需供给细胞以正常的温度，渗透压，PH等。,6,活体染色,7,较为常见的活体染色剂,詹纳斯绿B(Janus green B)中性红台盼蓝(trypan blue),8,詹纳斯绿B(Janus green B),专一用于线粒体的染色。它可以和线粒体中的细胞色素C氧化酶结合，保持氧化状态(即有色状态)呈蓝绿色,而在周围的细胞质中染料被还原,成为无色状态。必须指出的是，只有具有活性的细胞色素C氧化酶才能够把詹纳斯绿B氧化，从而使它显出颜色,9,人口腔上皮细胞的线粒体分布,在实验过程中务必保持所取的材料的活性。通常，需要把生物材料置于的冰水浴低温中，并且操作要迅速。,10,11,中性红,中性红是液泡系的特殊活体染色剂，它可将不同发育时期的液泡染成不同深度的红色，在细胞处于生活状态下细胞质和核不被染色，该染料对液泡系具有一定专一性。,12,13,液泡系的中性红染色点经观察,14,台盼蓝(trypan blue),台盼蓝：正常的活细胞，胞膜结构完整，能够排斥台盼蓝，使之不能够进入胞内；而丧失活性或细胞膜不完整的细胞，胞膜的通透性增加，可被台盼蓝染成蓝色。通常认为细胞膜完整性丧失，即可认为细胞已经死亡，这与中性红作用相反。因此，借助台盼蓝染色可以非常简便、快速地区分活细胞和死细胞。台盼蓝是组织和细胞培养中最常用的死细胞鉴定染色方法之一。注意凋亡小体也有台盼蓝拒染现象。,15,16,实验用品,材料：黄豆根尖、洋葱、小鼠。器械：显微镜、镊子、刀片、剪刀、解剖针、表面皿、载玻片、盖玻片、吸管、收水纸等。试剂：Ringer氏液 13000中性红溶液 15000詹纳斯绿B 台盼蓝染色液 香柏油、二甲苯、蒸馏水等,17,实验方法,1.液泡系的中性红活体染色,取黄豆芽的根尖处的纵切面 于载玻片上的中性红染液中染色510min 吸去染液，滴一滴Ringer液 盖上盖玻片进行镜检,18,2.线粒体的活体染色 用植物细胞观察线粒体的活体染色撕取洋葱鳞茎内表皮一小块于载玻片上的1/5000 Janus green B染色30min吸去染液，滴一滴Ringer液盖上盖玻片进行镜检,19,娶取鼠肝肝组织一小块，放入盛有Ringer氏液表面皿中洗去血液 于载玻片上的1/5000 Janus green B染色30min 撕开组织块，这样溶液中会有一些细胞或细胞群 吸取溶液，放在载玻片的Ringer氏液中 垫上两根短头发，盖上盖玻片进行镜检,用动物细胞观察线粒体的活体染色,为什么要用油镜观察，植物细胞却不用？为什么要垫上两根短头发？,思考,20,3.人口腔粘膜上皮细胞线粒体的超活染色观察,清洁载玻片放在37恒温水浴锅的金属板上滴2滴1/5000 Janus green B染液用牙签口腔颊粘膜处稍用力刮取上皮细胞刮下的粘液状物放大载玻片的染液滴中染色10l5min(注意不可使染液干燥，必要时可再加滴染液)盖上盖玻片,显微镜下观察,21,4.台盼蓝染色鉴定细胞死活,取小鼠腹腔水细胞于洁净载玻片上滴加1%台盼蓝1滴盖上盖玻片于显微镜下进行镜检,22,注意事项,对口腔上皮细胞进行染色时不可使染剂干燥，可适当补加染液。在对植物进行观察时一定要让材料尽量展开。詹纳斯绿B(Janus green B)溶液现用现配，以保持它的充分氧化能力。试验中速度要快，以免组织细胞死亡,23,思考题,所观察到的液泡大小是否有差别，染色深度是否一样，并绘图加以说明。所观察到线粒体分布在细胞何处呈什么颜色，其形状如何，绘图加以说明。比较线粒体在动、植物中的分布、颜色，其形状如何?,24,thanks,