生物大分子的分离纯化技术.ppt
生物大分子的分离纯化技术,生物样品的特点:生物活性复杂性内容:生物样品的常规分离纯化方法临床及生化分析样品的预处理生物大分子的电泳分离纯化技术生物大分子的色谱分离纯化技术,生物样品的常规分离纯化方法,透析 微过滤盐析冷冻干燥离心,透 析,基本原理透析膜:材料:火棉胶(Collodion),玻璃纸(Cellophane),纤维素(Cellulose)纤维透析管的处理:1%乙酸水溶液 1h,碱性EDTA(1%Na2CO3,1 mM EDTA)煮1h,纯水清洗,保存.透析液:水,缓冲液,高分子的浓溶液Donnan效应:pH变化(勤换透析液,使用大量的透析液),Donnan效应:,微过滤的类型:深层滤器(Depth Filter):滤膜滤器(Screen Filter):纤维素醋酸酯(硝酸酯)微过滤技术的应用:溶液的澄清微量沉淀物的收集细菌细胞的收集,微过滤,盐析,基本原理：在盐浓度很低时，蛋白质的溶解度随盐浓度的升高而增加，这称为盐溶；随盐浓度不断增加，蛋白质的溶解度不断降低而沉淀析出，即盐析。盐析实验应注意的问题：盐类的选择：硫酸铵（767g/l,25)盐的饱和度：温度：室温或4 pH：等电点 蛋白质的浓度：,冷冻干燥,基本原理：又称升华干燥，是在低温、副压下进行干燥的方法。冷冻干燥的条件：温度，-10-40；真空度，1340 Pa。,离心,基本原理种类：普通离心机（6000rpm)，高速离心机(25000 rpm)，超速离心机转子：固定角度式，悬挂吊桶式,离心(2),离心力和相对离心力(Relative centrifugal force)：F=m2r;Fcf=(1.11910-5)(rpm)2r沉淀速度与沉降系数：F摩擦=fv F净=(Mp-Ms)2r-fv沉降系数：沉淀速度与离心力的比率（单位离心场中颗粒的沉降速度），蛋白质核酸病毒等的沉降系数介于110-13到20010-13秒的范围.以110-13s 为一个单位,称为斯韦德贝格单位(Svedberg)，用S(大写)表示.,离心(3),离心技术的类型：最大速度方法：移动界面（Moving Boundary)超速离心法 移动区带(Moving Zone)超速离心法 等密度方法(Iso-density)：,临床及生化分析样品的预处理,样品的类型、采集与保存 酶样品的准备,样品的类型、采集与保存,样品的类型：,样品的类型、采集与保存,样品的采集 血样：全血：肝素抗凝（0.020.2mg/ml)血浆：2000g离心10min 血细胞：血清：530 min自凝分离 尿样：酸式采集（HCl或硼酸，pH2.5)，碱式采集(碳酸钠，几滴苯酚抗菌）唾液：组织样品：液氮等冷冻,酶样品的准备,酶活性的保持 控制纯化过程中的pH、温度及有机试剂 加入载体蛋白防止酶的吸附，如:BSA 加入辅助因子保护活性部位,如:EDTA,巯基乙醇，谷胱甘肽 抑制蛋白酶的水解作用，如:氟代磷酸二异丙酯，甲（乙）酰-亮-亮-精三肽等 亲水分子稳定剂，如甘油，糖醇等样品制备 从组织或器官制备样品 从组织或器官培养液中制备样品 从生物体液中制备样品（5000 rpm,15 min)从细胞培养液制备样品,电泳分离纯化技术,聚丙烯酰胺凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳高效毛细管电泳,电泳分离纯化技术,基本原理 V=e E(e 为电泳迁移率,即电场强度为1 V/cm 时的迁移速率.)影响电泳分离的因素:物质本身的结构和性质:荷电性质,形状 支持介质:吸附作用,电渗作用 溶液介质:pH,离子强度 电场强度:常压 500 V,聚丙烯酰胺凝胶电泳,聚丙烯酰胺凝胶的结构和性质 凝胶的机械强度、弹性、透明度和黏度等取决于凝胶的总浓度:,聚丙烯酰胺凝胶电泳(2),凝胶电泳的装置 柱型(Column Gel):10cm6cm 板型(Slab Gel):12cm12cm或14cm16cm;玻璃板间距1.75或1.5 cm.不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳(盘状电泳)电荷效应 浓缩效应 分子筛效应,不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳,聚丙烯酰胺凝胶电泳的应用,SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质的分子量 1%SDS+0.1 M 巯基乙醇分子量1.01042.0105蛋白质的等电聚焦(Isoelectric Focusing,IEF)原理pH梯度的形成与保持,琼脂糖凝胶电泳,特点：适合分子量大的分子；无毒；分辨率高；重复性好胶浓度：0.5%3%；分离19.0107DNA片段0.51.0%胶分离0.530 kb DNA,1.01.5%胶分离小片段,琼脂糖凝胶电泳的应用,限制性核酸内切酶存在下酶切DNA片段的分析DNA超螺旋结构的鉴定DNA分子量的测定脉冲场凝胶电泳,DNA分子量的测定,高效毛细管电泳,仪器,毛细管:I.D,25100m;O.D.,100400m;L,0.11 m进样系统:nLpL,流体力学方法和电动进样高压直流电源：30kV,1300A检测 紫外-可见吸收法荧光检测法电化学检测法质谱法,高效毛细管电泳,基本概念：电泳淌度电渗流分析参数：淌度和迁移时间分离效率分离度,高效毛细管电泳分离模式,毛细管区带电泳（Capillary Zone Electrophoresis,CZE)毛细管胶束电泳（Capillary Micellar Electrokinetic Chromatography,CEKC)毛细管凝胶电泳（Capillary Gel Electrophoresis,CGE)毛细管等电聚焦（Capillary Isoelectric Focusing,CIEF),CGE的应用,DNA序列分析蛋白质分析物理胶CZE,生物大分子的色谱分离纯化技术,排阻色谱亲和色谱离子交换色谱反相及疏水作用色谱液液分配色谱,亲和色谱,固定相葡聚糖凝胶，聚丙烯酰胺凝胶，琼脂糖凝胶，聚丙烯酰胺琼脂糖混合凝胶，（与凝胶色谱相似）配基：分离抗体用抗原，半抗原分离酶用底物，抑制剂，辅助因子等通用型配基，巯基丙基琼脂糖,含巯基配体亲和色谱分离原理,亲和色谱,配基与载体的结合琼脂糖的溴化氰活化法6-氨基己酸琼脂糖和,1,6-己二胺琼脂糖亲和层析的特点：层析柱短配基与大分子间以氢键离子键或疏水相互作用结合,
