生化蛋白质化学.ppt

,第一章 蛋白质第一节 蛋白质的生物学意义 第二节 蛋白质组成和氨基酸的性质 一 蛋白质的元素组成 C 5055%H 68%O 2030%N 1518%S 04%蛋白质中含N量相当接近，平均值16%氮元素的质量 蛋白质的质量 16%蛋白质的质量 氮元素的质量 6.25二 蛋白质的氨基酸组成 氨基酸是蛋白质的基本结构单位 构成蛋白质的氨基酸有20种,（一）氨基酸结构上的共同特点1 除Pro外，其余19种氨基酸均为氨基酸 2 除Gly外，其余19种氨基酸上的碳原子都是手性碳原子分子具有手性 3 除Gly外，其余19种氨基酸分子具有不对称性，所以有光学活性 组成蛋白质的氨基酸都属L型（二）氨基酸的分类 1 根据组成蛋白质的20种氨基酸的侧链R基团的化学结构将其分四大类 一氨基一羧基氨基酸 脂肪族氨基酸 一氨基二羧基氨基酸及其酰胺 二氨基一羧基氨基酸 芳香族氨基酸 杂环氨基酸 杂环亚氨基酸,2 按照氨基酸侧链R基团的极性，把20种AA分为两大类：不带电荷（6种）极性氨基酸（11种）带负电荷（2种）带正电荷（3种）非极性氨基酸（9种）(三)非蛋白氨基酸例如：1 谷氨酸脱羧产生-氨基丁酸 Glu脱羧酶 L-Glu-氨基丁酸（GABA）抑制神经递质2 组氨酸脱羧产生组胺 His脱羧酶 组氨酸 组胺 血管扩张剂3 天冬氨酸脱羧生成-丙氨酸 Asp脱羧酶 Asp-Ala 参与泛酸（VB3）组成此外还有瓜氨酸(Cit)、鸟氨酸（Orn）,（三）氨基酸的解离和两性性质 1.等电点的定义：2.等电点的计算:两性离子两侧Pk值之和的一半 3.性质:溶解度最小（四）氨基酸的理化性质 1 物理性质：2 化学性质：与茚三酮的反应 除Pro(黄色)其余AA与之反应呈兰紫色 与HNO2反应反应放出的N2，一半来自氨基酸-氨基，一半来自亚硝酸的氮 与甲醛的反应：与2，4-二硝基氟苯(DNFB)反应 与异硫氰酸苯酯(PITC)的反应,第三节 蛋白质的结构一 蛋白质的一级结构（一）肽 1.定义:一个氨基酸的-COOH可与另一个氨基酸的-NH2缩合失去一分子水，形成的酰胺键称肽键，其化合物称为肽 2.命名 3.生物活性肽：调节生物机体生命活动或具有某些生理活性的寡肽和多肽的总称。谷胱甘肽(GSH)催产素和加压素脑肽,（二）蛋白质的一级结构 1.定义:肽链中氨基酸的排列顺序 2.稳定因素:肽键(主要)、二硫键(次要)3.举例:胰岛素分子量5700左右，牛胰岛素MW5734，由两条肽链组成。胰岛素 A链（21个氨基酸残基）、B链（30个氨基酸残基）A6A7 三个二硫键 A7B7 A20B19,（一）蛋白质的二级结构1.定义:是指蛋白质多肽链主链的折叠和盘绕方式2.表现形式：-螺旋结构、-折叠结构、-转角结构、无规则卷曲（自由回转）1-螺旋结构基本要点：这种-螺旋模型，每隔3.6个氨基酸残基螺旋上升一圈。螺距是0.54nm，每个氨基酸残基的垂直距离是0.15nm。螺旋上升时，每个残基沿轴旋转100。-螺旋体中氨基酸残基侧链R基团伸向外侧，相邻的螺旋圈之间形成链内氢键，氢键的取向几乎与中心轴平行。-螺旋有左手螺旋和右手螺旋两种，天然蛋白质的-螺旋绝大多数都是右手螺旋，仅在嗜热菌蛋白酶的晶体结构中发现226229位氨基酸残形成左手螺旋。,稳定及影响因素:氢键多肽链中有Pro（或羟脯氨酸）时螺旋中断多肽键中存在大量Gly、Ser、Thr大量存在也不利于形成-螺旋2-折叠结构-折叠结构与-螺旋结构的差异是：1.-螺旋肽链是卷曲棒状螺旋，而-折叠的肽链几乎是完全伸展的2.都以氢键维持结构的稳定性 3.-折叠结构中每一残基间的垂直距离为0.35nm-折叠结构分为平行和反平行两种形式,从能量考虑,反平行更为稳定3-转角结构 4 自由回转（无规则卷曲）,(二)超二级结构和结构域（1）超二级结构:指若干相邻的二级结构中的构象单元彼此相互作用,形成有规则的,在空间上能辨认的二级结构给合体。常见超二级结构形式：（2）结构域：多肽链在超二级结构基础上进一步盘绕折叠成的近似球状紧密结构。一条长的多肽链首先折叠成几个相对独立的结构域，再缔合成三级结构。,（二）蛋白质的三、四结构 1 蛋白质的三级结构(1)定义:由-螺旋、-折叠等二级结构之间相互配置而成的构象(2)举例:肌红蛋白肌红蛋白由一条多肽链构成，有153个氨基酸残基和一个血红素辅基，MW为17800，通过X-射线衍射图谱测出其空间结构有下列特征：整个分子中肽链有77%呈-螺旋体构象 分子是一个外圆中空的不对称结构，有8段长度为724个氨基酸残基的-螺旋体。在拐角处，-螺旋体受到破坏（Pro、Ile、Ser等出现在拐角处）分子排列非常紧密，其内部留有的空间仅能容纳4个水分子,氨基酸残基的全部极性R基团几乎全部位于分子表面，并且呈水化状态 几乎全部非极性或疏水性R基团都位于分子内部，不与水接触。对已被检查的不同种属的肌红蛋白而言，虽然其氨基酸组成稍有差别，但其多肽链的总构象完全是一致的，因此氨基酸顺序中保留或不变的残基，与决定弯折的位置和直的段节的走向有关2 蛋白质的四级结构(1)定义:由两条或两条以上的具有三级结构的多肽链聚合而成的特定构象(2)举例:血红蛋白的结构：MW 65000 574个氨基酸残基组成 4个亚基组成（22）每个亚在含有一个血红素辅基 亚基含141个氨基酸残基 亚基含146个氨基酸残基 血红素辅基的铁为二价铁原子，但在输氧时，铁的价态不变,（三）蛋白质分子中的共价键与次级键稳定各级结构因素:一级结构:肽键（为主）、二硫键（为辅）二级结构：氢键三级结构和四级结构：非共价键（氢键、范德华力、盐键、疏水键、酯键）三 蛋白质分子结构与功能的关系（一）蛋白质一级结构与功能的关系 1 种属差异 2 一级结构与分子病 分子病：某种蛋白质分子一级结构的氨基酸序列与正常有所不同的遗传病。镰刀型红细胞性贫血病,（二）蛋白质构象与功能的关系 第四节 蛋白质的理化性质一 蛋白质的分子量 测定蛋白质的常用方法是：渗透压法 简单、设备要求不高、灵敏度较差 超离心法 准确、可靠、设备要求高 凝胶过滤 仅测定近似值 聚丙烯酰胺凝胺电泳 仅测定近似值常用超离心法测定分子量 S:单位离心场强度的沉降速度,称为沉降系数,数值一般在110-13-20010-13秒范围内,人们通常将110-13秒称为一个S,如某蛋白质沉降系数为810-13秒可写为8S,沉降系数的大小基本上反映了蛋白质分子量大小,二 蛋白质的两性电离及等电点蛋白质也是两性电解质（N端含氨基、C端含羧基）等电点时蛋白质性质的特殊性 总净电荷为零，无相互排斥作用，所以最不稳定，溶解度最小，极易借静电引力迅速结合成较大的聚集体，而沉淀出来，利用这一性质可以分离、提纯蛋白质。粘度、渗透压、膨胀性以及电导均为最小实际应用：缓冲作用 电泳分离 蛋白质的两性解离与植物根部吸收养分的关系,三 蛋白质的胶体性质蛋白质水溶液是一种比较稳定的胶体，原因有二：蛋白质颗粒表面形成一层水膜（水化膜）在非等电点状态下（pHpI）蛋白质颗粒带同种电荷（同种电荷）四 蛋白质的变性、沉淀与凝固1.什么叫变性作用？天然蛋白质受理化因素的影响，分子内部原有的高度规律性结构发生变化，致使蛋白质的理化性质和生物学性质都有所改变，但并不导致蛋白质一级结构的破坏，这种现象叫变性作用，变性后的蛋白质称变性蛋白质。2.引起蛋白质变性的因素 化学因素 强酸、强碱、胍、去污剂、重金属离子、三氯乙酸 磷钨酸、单宁酸（鞣酸）、浓乙醇等 物理因素 加热（70100）、剧烈振荡或搅拌、紫外线、X-射线 超声波等,3.变性蛋白质的特征 失去生物活性 Hb变性后失去运输O2的功能，酶无催化功能 胰岛素失去调节血糖水平的生理机能 溶解度降低、易沉淀（主要是疏水基团外露，失去水膜）结晶能力丧失 粘度增加 球形（粘度小）线形（粘度大）变性蛋白质易被酶（水解酶）消化水解4.变性机制 主要是由蛋白质分子内部的结构发生改变而引起的 5.蛋白质变性的应用,五 蛋白质的沉淀反应 1 盐析(可逆)因加入大量盐而使蛋白质沉淀析出的现象称盐析 原因:破坏水化膜及中和电荷血清 球蛋白 或 加(NH4)2SO4至半饱和+白蛋白（清蛋白）蛋清 上清液 加(NH4)2SO4至饱和+上清液2 加有机溶剂(有条件可逆)原因:有机溶剂亲水性强,破坏水化膜,3 加入重金属盐(不可逆)NH3+NH3+Pr+Ag+Pr COO-COOAg4 加入某些酸类(不可逆)5 加热（不可逆）蛋白质的沉淀、变性和凝固的关系 变性 不一定 不一定 沉淀 凝固(变性+沉淀)一定,六 蛋白质的紫外吸收引起紫外吸收原因:共轭体系(单双键交替排列)Trp max=279nm 强(主要)Tyr max=278nm 中(主要)phe max=259nm 弱 肽键 max=180-230nm 七 蛋白质的呈色反应 反应名称 试剂 呈现颜色 呈色反应的功能基团双缩脲反应 CuSO4(OH-)红紫色max=540nm 二个以上的肽键黄色反应 浓HNO3 白黄 Tyr、Trp米伦氏反应 Hg+HNO3(浓)白红 Tyr（酚类）乙醛酸反应 乙醛酸+浓H2SO4 紫色环 吲哚基（Trp）坂口反应 Br2(Cl2)+-萘酚(OH-)红色 胍基（Arg）酚试剂反应 福林试剂 蓝色 酚基（Tyr）,八 蛋白质的分离与纯化一般原则：1 选材（应选择含量较高，易提取的材料）2 组织或细胞的破碎（使蛋白质从溶解的状态释放出来，并保持原有的天然状态，不失去生物活性）3 分离、提纯（要经常检查所需蛋白质的提纯程度）常见的一个例子：加工豆制品大豆 浸泡 粉碎 浆状物 过滤 生豆浆 加热熟豆浆 加入石膏 静置 絮状物 浇模、压去水分 豆制品,第五节 蛋白质的分类 球状蛋白质（一般易溶于水，分子接近球状）一 分子形状 纤维状蛋白质（X/Y 510,分子细而长）简单蛋白质（水解产物为-AA）二 分子组成（根据溶解度又分为七类，具体见教材）结合蛋白质（水解产物除-AA外，还有非氨基酸成分）（根据辅基的不同又可分为五类）1 核蛋白 蛋白质+核酸2 糖蛋白与蛋白聚糖 蛋白（蛋白聚糖）由蛋白质和糖以共价键相连而成 一般认为：糖含量 蛋白质含量 称为蛋白聚糖,3 脂蛋白 蛋白质部分（脱辅基蛋白或载脂蛋白）脂蛋白 脂类4 色蛋白 色素+蛋白质5 磷蛋白 磷酸+蛋白质,异硫氰酸苯酯：多肽链N末端测定及肽链测定丹磺酰氯：多肽链N末端测定脲：变性剂，可使蛋白质结构中的氢键发生断裂，增加了非极性分子和侧链的溶解度，减少了疏水作用，脲还深入到蛋白质分子的内部，影响蛋白质分子的密积度。6mol/LHCl：水解蛋白质，但Trp被破坏。巯基乙醇:催化蛋白质完全变性和解聚,解离成亚基或单个肽链.破坏二硫键 过甲酸：断开多肽链内二硫键水合茚三酮：氨基酸的组成分析胰蛋白质酶：水解精氨酸、赖氨酸羧基端的肽键胰凝乳蛋白酶：水解芳香族氨基酸羧基端的肽键溴化氰:可断裂甲硫氨酸的羧基形成的肽键。水解后甲硫氨酸残基转变为C-末端高丝氨酸残基。,