生化分离工程实验.ppt
生化分离工程实验,指导老师：何 进 教 授 电子邮箱：联系电话：,助教学生：赵有文 刘 舒 胡轶敏 危雅乐,菌株的优化培养,总DNA或RNA的抽提,PCR或RT-PCR扩增目的基因,乙醇沉淀回收线性化片断,大肠杆菌表达载体pET-28,酶连产物转化E.coli DH5,挑取转化子并抽提质粒验证表达质粒(PCR及酶切验证),检索感兴趣的基因（hfq/fabz）,直接优化并合成,连T载测序,结晶,结构解析,本次试验内容,本次试验的主要内容,His-Tag系统,pMAL系统,无细胞体系,目的基因的背景资料,Hfq,fabZ,Hfq是一个高度保守的RNA结合蛋白，最初被发现是作为大肠杆菌RNA噬菌体Q复制所必需的管家因子。现在则被认为是细菌基因转录后调控的关键因子，广泛参与细菌多种生命活动的调控。,大肠杆菌fabZ基因编码3-羟基脂酰ACP脱水酶，是大肠杆菌中的必须基因，该基因的突变会导致细菌细胞的死亡。,生化分离工程实验（星期五）,一，接种 按1%的接种量将两种菌株分别加入到含抗生素的LB培养基中,做好标记（写清组号，菌株信息、抗性），统一放于第八组台面。,生化分离工程实验（星期五）,将超净台内PA瓶中剩余的菌液用枪吸取200 l于1.5 ml离心管中，10000 rpm/min离心1 min，弃上清，加入200 l的无菌水洗涤菌体上残留的培养基 10000 rpm/min离心1 min，弃上清，然后重悬于40 l灭过菌的去离子水中，100 煮15 min，10000 rpm/min离心1 min，取上清9.2 l作为菌落PCR的模板。,二，菌液PCR（验证目的基因已转入宿主菌中）,PCR体系,H2O 9.2 l10 X PCR buffer 2.5 ldNTP 2.0 l上游引物 0.5 l下游引物 0.5 lTaq酶 0.3 l模板 10 l总体积 25 l,PCR程序,95 5 min95 35 s56 40 s72 60 s72 10 min25 10 min,Cycle 30,注：用质粒做阳性对照，水做阴性对照，不用重复，PCR管上做好标记！,The pMAL-c2 series of vectors have an exact deletion of the malE signalsequence,resulting in cytoplasmic expression of the fusion protein.ThepMAL-p2 series of vectors contain the normal malE signal sequence,which directs the fusion protein through the cytoplasmic membrane,and the fusion proteins can be exported to the periplasm,三，诱导,注：在加入IPTG之前，摇匀菌液并各取1 ml于1.5 ml的离心管中，做好标记（组号，菌液名）记作“诱导前”，放于第八组桌面的离心管板中，于20 保存。,四，配试剂,五，PCR结果,依据每组发的纸条进行,生化分离工程实验（星期五）,将加入诱导剂后的菌液再放入37 200 rpm/min的摇床中诱导培养4-5小时后收集菌体。,注：在离心沉淀之前摇匀菌液取1 ml于1.5 ml的离心管中，做好标记（组号，菌液名）记作“诱导后”放在第八组的离心管板上。离心时用天平严格配平，沉淀重悬后做好标记放于第八组桌面上！,六，收菌,组氨酸和Ni-NTA,亲和作用原理,6His/Ni-NTA亲和纯化步骤,系统原理示意图,pMAL,Ni柱的清洗与保存,用水洗3次（去掉保存的20%乙醇）,充电（装满NiSO4，温和摇动后自然沉降）,洗涤（3次水洗，去掉游离的Ni),平衡（2次的binding buffer洗）,HisTag 蛋白质的纯化步骤,上样（每次15ml，样品要与柱子充分结合）,加washing buffer（用100%TCA检测不出沉淀为止）,加 Elution buffer（一般收集8ml）,重复第48步,第 1步：2倍体积 6 M 盐酸胍，0.2 M醋酸 第 2步：2倍体积水 第 3步：1倍体积 2%SDS（注意低温容易析出）第 4步：1倍体积 25%乙醇 第 5步：1 倍体积 50%乙醇 第 6步：1 倍体积 75%乙醇 第 7步：5 倍体积 100%乙醇 第 8步：1倍体积 75%乙醇 第 9步：1倍体积 50%乙醇 第 10步：1倍体积 25%乙醇 第 11步：1倍体积水 第 12步：5倍体积 100 mM EDTA，pH8.0 第 13步：3倍体积水,由于 EDTA处理后仍可有少量蛋白未能完全释放，建议在纯化不同蛋白时应另换 HisBind 树脂。,树脂的再生,当柱流速明显下降，或树脂在使用离子化缓冲液处理之后没能显示深蓝绿色，则树脂需要更彻底的清洗处理。,直链淀粉柱的再生,生化分离工程实验（星期六）,一、裂解细胞,将冷冻保存的细胞团在室温下解冻，冰上破碎至菌液成澄清（200-300w超声610s-10s，约20 min）,天平严格配平后10000*g，4，离心20 min。上清取1 ml于1.5 ml离心管中，作标记为“上清”，沉淀用1 ml对应的buffer（his-tag为binding buffer，pMAL为column buffer）重悬后，保存在1.5 ml的离心管中，标记为“沉淀”，做好组号和菌株标记后，放于第八组台面。,二，蛋白纯化,注：收集到的蛋白做好标记后须在冰上保存，避免其失活,pMAL系统MBP标签的切除从A595最大的几管(一般是第一、二管)取100 l用于蛋白酶FactorXa的酶解，在100 l洗脱液中取15 ul保存在pcr管中，作为酶切对照，剩下的加入2 ul的FactorXa后置于摇床上震荡反应，室温下反应18 h，分别于第1h、3 h、6 h、17 h取样15 l。,三，SDSPAGE样品的制备,将收集到的14管目的蛋白和之前保存的“上清”“沉淀”“穿透”（共6管）蛋白各取出20 ul于对应的已经标记的1.5 ml离心管中，加入20 ul SDS-PAGE loading buffer，将先前保存的“诱导前”“诱导后”（共4管）于10000rpm/min离心1min，弃上清，沉淀用15ul对应的buffer重悬，再加入15ul SDS-PAGE loading buffer，沸水浴15 min后，放于第八组台面。,无细胞体系,生化分离工程实验（星期六）,四，Bradford protein assay,1、标准曲线的制作,（1）标准蛋白质溶液：用牛血清白蛋白（BSA)配置成1.0mg/ml的标准蛋白质溶液。,（2）考马斯亮蓝G-250染料试剂：称100mg考马斯亮蓝G-250溶于50 ml 95%的乙醇后，再加入120 ml 85%的磷酸，用蒸馏水稀释至1 L。,每加完一管立即在漩涡振荡器上混合，25 min后以1号为对照调零测A595以标准蛋白质量（ug）为横坐标，用吸光度A595为纵坐标作标曲,注;震荡过程中不要太剧烈，以免产生较多气泡而无法消除,五，未知蛋白浓度的测定,将保存的纯化的蛋白各取50 ul，加50 ul蒸馏水后再加入5 ml考马斯亮蓝G-250染液试剂，漩涡震荡后静止25 min，以0.1 ml水加5.0 ml的G-250试剂调零，测其在595nm处的吸光度。,生化分离工程实验（星期六）,六，配制SDS-PAGE,每组配两块，均采用15孔梳子,注：在配胶前注意梳子厚度（1.0mm和1.5mm）与胶板厚度的一致性,生化分离工程实验（星期天）,跑SDS-PAGE点样：所有的样品和蛋白Marker点样前都要沸水浴5分钟使蛋白质完全变性。一般的点样量为10-20 ul。(记录点样顺序)点样完毕后即可开始电泳，先以80伏电压跑15-20分钟，蛋白质通过积层胶后，更换到120伏，待溴酚蓝接近分离胶底部后停止电泳，取下胶板，小心撬开胶板割取分离胶，放入染色皿中，加入一定染色液（没过胶面即可）。置于摇床上染色3小时左右。染色完毕后，回收染色液，加入脱色液，摇床脱色数次，最后一次可以过夜脱色。,SDS-PAGE的原理,聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺(Acr)和交联剂N，N亚甲基双丙烯酰胺（Bis）在催化剂作用下，聚合交联而成的具有网状立体结构的凝胶，并以此为支持物进行电泳。,聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE),阴离子表面活性剂十二烷基磺酸钠SDS,打断蛋白质的氢键和疏水键，包裹蛋白,根据蛋白所带电荷差异和分子大小不同来分离,掩盖电荷差异和形状区别，而只与分子量有关,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,是以聚丙烯胺凝胶作为载体的一种区带电泳,引发剂是过硫酸铵(AP)，催化剂N、N、N、N四甲基乙二胺（TEMED），它的碱基催化AP产生氧自由基，激活单体形成自由基，发生聚合。化学聚合形成的凝胶孔径较小，且重复性好，用来制备分离胶；,不连续系统：缓冲液离子成分，pH，凝胶浓度及电位梯度均不连续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应，分子筛效应，还具有浓缩效应，因而其分离条带清晰度及分辨率均较前者佳,本实验采用垂直板状不连续系统。所谓“不连续”是指电泳体系由两种或两种以上的缓冲液、pH 和凝胶孔径等所组成。,浓缩效应和分子筛效应,
