植物基因工程载体及其构建.ppt

第三章 植物基因工程载体及其构建,第一节 载体概述,1.载体概念,载体(vector)：能够承载外源基因，并将其转入受体细胞进行扩增和表达的DNA分子。,运送外源基因高效转入受体细胞；为外源基因提供复制能力和整合能力；为外源基因的扩增或表达提供必要的条件；,功能,所以，目的基因能否有效转入受体细胞，并在其中维持高效表达，很大程度上取决于载体。,具备复制原点，在宿主细胞内能够自主复制；具备合适的酶切位点，供外源片段插入；含有供选择转化子的标记基因；适当的拷贝数：较高的拷贝数，便于回收、制备；载体的安全性：对受体细胞无毒害，不能随便转移；载体大小：原则上要求载体越小越好；如果需要外源基因的表达：启动子。,载体应具备的条件,2.载体的种类,人工染色体载体、线粒体载体、叶绿体载体等,按功能分：,克隆载体：主要用来克隆和扩增DNA片段，能带动外源基因在宿主细胞中复制扩增。表达载体：除具有克隆载体的基本元件外，还具有转录、翻译所必需的DNA元件，使外源基因在宿主细胞中有效表达。整合载体：将目的基因插入到受体染色体中。,目的基因克隆载体,中间载体,卸甲载体,转化载体,其功能是保存和克隆目的基因。与微生物基因工程相似，通常是由多拷贝的E.Coli小质粒为载体。,切除致瘤基因的Ti质粒或Ri质粒，是构建转化载体的受体质粒。,中间克隆载体,中间表达载体,大肠杆菌质粒插入T-DNA片段及目的基因、标记基因等。是构建中间表达载体的基础质粒。,含有植物特异启动子的中间载体。作为构建转化载体的质粒。,最后用于目的基因导入植物细胞的载体，工程载体。由中间表达载体和卸甲载体构建。,第二节 质粒载体,质粒(plasmid)：存在于细菌或真菌染色体外的小型环状(线型质粒DNA分子线虫、衣藻等)双链DNA分子(酵母的“杀伤质粒”是RNA)，可自身复制和表达。,不是寄主生长所必需的，但可以赋予寄主某些抵御外界环境因素不利影响的能力（带有抗性基因等）。分子量在1-200 kb之间。,1、质粒（plasmid）概念,质粒空间构型,超螺旋：共价闭合环状DNA,开环DNA：1条链上有一至数个缺口,线型DNA：,最快的是超螺旋，其次是线性DNA，最慢的是开环DNA。,2、质粒（plasmid）构象,3、质粒的自主复制性,质粒能利用寄主细胞的DNA复制系统进行自主复制质粒。DNA上的复制子结构决定了质粒与寄主的对应关系根据在每个细胞中的分子数（拷贝数）多寡，质粒可分为两大复制类型：,4、质粒的不相容性,同种的或亲缘关系相近的两种质粒，含有相似复制子结构，不能同时稳定地保持在一个细胞内的现象，称为质粒不相容性。不相容性的质粒组成不相容性群。,在第二个质粒导入后，在不涉及DNA限制系统时，不相容的质粒一般为利用同一复制系统，质粒分配到子细胞时会发生竞争，随机挑选，最终放大。,5、质粒的可转移性,接合型质粒：能在天然条件下自发地从一个细胞转移到另一个细胞（接合作用）。甚至能使寄主染色体上的基因随其一道转移到受体菌种。非接合型质粒：不能再天然条件下独立地发生接合作用。某些非接合型质粒在接合型质粒的存在和协助，也能发生DNA转移。由mob、tra基因顺式因子bom及其内部的转移缺口位点nic决定。,6、携带特殊的遗传标记,物质抗性：抗生素、重金属离子、毒性阴离子、有机物物质合成：抗生素、细菌毒素、有机碱,对重组DNA分子的筛选十分重要！,选择标记：用于转化子的挑选；筛选标记：用于重组子的挑选；转化子：成功转化了载体的宿主细胞；重组子：真正含有重组DNA的转化子。,按用途可分为选择标记基因和筛选标记基因。,筛选标记基因,插入失活法,互补筛选法,lacZ编码-半乳糖苷酶，乳糖及其衍生物可诱导其表达(乳糖既是诱导物,也是底物)；IPTG：乳糖衍生物，可作为lac操纵子的诱导物，但不能作为反应底物；X-gal：可作 lac操纵子的底物，不能作为诱导物。还可作为生色剂，被-半乳糖苷酶分解后产生兰色物质，使菌落呈现兰色。,lac Z M15 放在F质粒上，随宿主传代；lac Z 放在载体上，作为筛选标记；受体菌有JM系列、TG1和XL1-Blue等。,lac Z M15：缺失-半乳糖苷酶第11-41个aa；lac Z：只编码N端140个aa；,lac Z M15+lac Z=功能互补,在lac Z 编码区上游插入一小片段DNA(如51bp的MCS)，不影响-半乳糖苷酶的功能互补。但在该小片段DNA中再插入一个片段，将导致产生无互补能力的-半乳糖苷酶片段；,7、天然质粒载体的局限性,（1）分子量大，拷贝数低,第一个用于基因克隆的天然质粒pSC101，分子长 9.1 kb。,但只有一个EcoR I切点充当克隆位点，Tetr 作为筛选标志。,（2）筛选标志不理想，合适的单一酶切位点少,ColE1质粒的筛选标志是大肠杆菌素E1（colicin E1）。杀死不含ColE1 质粒的菌，形成“噬菌斑”。唯一的克隆位点 EcoR I 正好位于这个基因的内部。,改造策略：去掉多余片段：缩小质粒分子量，提高外源DNA片段的装载量；减少限制性酶切位点：缺失突变，限制性酶、核酸外切酶和连接酶.；提供多克隆位点易识别的选择标记：通过质粒之间的重组导入；安全性改造：质粒载体不能在细菌间随便转移；增加辅助功能：表达载体。,8、常用的质粒载体,（1）pBR322质粒载体,F.Bolivar和R.L.Rodriguez人工构建载体。,复制起点：pMB1系列（来源于ColE1）的高拷贝型复制起点，高达1000-3000个拷贝；Ampr基因：pSP2124质粒的Ampr基因；Tetr基因：pSC101的Tetr 基因；长度：4361 bp；选择标记：氨苄青霉素和四环素抗性；多克隆位点：24个克隆位点；,其中9个会导致Tetr基因失活（如BamH I、Hind、Sal I）；3个会导致Ampr基因失活（Sca I、PvuI、Pst I）。,衍生质粒：pBR325、pBR327及pAT153等。,（2）pUC质粒载体,University of California的J.Messing和J.Vieria于1978年，在pBR322的基础上改造而成。属正选择载体。,复制起点：pBR322的 oriAmpr基因：pBR322Ampr基因，不含原有酶切位点；lacZ启动子：大肠杆菌；lacZ基因：大肠杆菌lacZ的氨基酸片段；长度：约2.7 kb；克隆位点：10个连续的单一酶切位点，位于lacZ基因5端。选择标记：氨苄青霉素和蓝白斑筛选；,pUC7、pUC8、pUC9、pUC10、pUC11、pUC18、pUC19,更小的分子量；选择方便：正向选择，可显色和抗菌素双重直接选择；克隆便利：具有多克隆位点，外源DNA方便插入；测序方便：pUC的MCS与M13噬菌体载体的MCS完全相同，便于把外源DNA转移到M13载体上测序。,（3）pGEM系列载体,由pUC派生而来。与pUC的主要区别是在MCS的两侧分别加了一个噬菌体启动子T7和SP6。可对插入片段进行转录。还加入了丝状噬菌体f1的复制起点。,（3）pBluescript II KS()系列载体,在MCS的两侧分别加了一个噬菌体启动子T7和T3。可对插入片段进行转录。还加入了丝状噬菌体f1的复制起点。,9、PCR产物克隆载体,（1）T载体,PCR产物往往在3端突出一个或多个A，将T-载体的MCS中部已经切开，各有一个3端突出的T。所以能与这个载体直接连接，这种克隆称为T-A克隆。,目前，目的基因的获得几乎都是用PCR的方法，如何将PCR产物连接到载体上？,克隆载体线性化；克隆载体末端补平；克隆载体末端加T。,商业化T载体一般来说，商业化的T载体多是先使用平端限制性内切酶（如EcoRV）将克隆载体进行线性化，然后再单独加入dTTP和Taq酶7275反应，进行末端的加T。自制T载体一种常见的自制方法是利用限制性内切酶制造出具有单个T末端突出的片段，最常用的内切酶为XcmI，其识别和切割特点如下：,TOPO技术,拓扑异构酶I在位点CCCTT切断并松弛超螺旋DNA，然后重新连接末端。这样，其同时作为限制酶和连接酶。,TOPO克隆是一种将拓扑异构酶与 T-载体相结合的 PCR 产物快速克隆系统 pCR-TOPO，无需 DNA 连接酶做连接。,3末端的突出 T 上共价结合了一个拓扑异构酶，当带 3 末端的突出 A 的 PCR 产物与该 T 载体互补配对时，拓扑异构酶 就将该缺口连接起来。,因为越来越多高确限度热稳定酶如Pfx、Pfu被用于PCR扩增，使到PCR后都只是平端产物。这种平端克隆往往效率低，并且有非特异性背景菌落产生，造成筛选困难。,（2）平末端PCR产物载体,TOPO-Blunt载体,在 lacZ基因的下游融合了一个 ccdB（Control of cell death）基因，该基因对大肠杆菌是致死的。载体切成线状，再与目标 DNA 连接，转化大肠杆菌。,外源 DNA 片段与载体连接后，ccdB 基因的表达受到阻断，重组质粒才能在大肠杆菌中存在下来。如果没有DNA片断插入，ccdB基因则会表达，造成细菌染色体的降解导致细菌死亡。,TOPO克隆高效性原理Topo连接反应有两个分子参与，而传统的连接反应有三个分子参与，其热力学上的优势导致5分钟的快速连接。,10、质粒提取,细菌培养和富集,细胞悬浮,细胞破碎,细胞碎片基因组去除,蛋白去除,质粒收集,溶液1：50 mM葡萄糖，25 mM Tris-Cl，10 mM EDTA，pH 8.0,溶液2：0.2 N NaOH，1%SDS；,溶液3：3 M 醋酸钾，2 M 醋酸,苯酚、氯仿抽提,异丙醇/乙醇沉淀，70%乙醇清洗,具备复制原点，在宿主细胞内能够自主复制；具备合适的酶切位点，供外源片段插入；含有供选择转化子的标记基因；适当的拷贝数：较高的拷贝数，便于回收、制备；载体的安全性：对受体细胞无毒害，不能随便转移；载体大小：原则上要求载体越小越好；如果需要外源基因的表达：启动子。,载体应具备的条件,11、大肠杆菌感受态制备及转化,（1）热激法,挑选单菌落,过夜振荡培养,取1ml菌液+50ml培养基2-3h，OD600=0.6,取1ml菌液+50ml培养基2-3h，OD600=0.6,低温低速离心收集细胞,0.1MCaCl2悬浮处理细胞,2ml0.1MCaCl2悬浮细胞，分装，-80保存。,感受态细胞制备,转化,取出感受态,冰浴解冻,加入连接产物/质粒,冰浴30 min,42热激90 S,冰浴1 min,加入1 ml LB培养基培养45 min复苏,产物体系不超过1/10,收集菌体，涂板筛选，过夜培养,（2）电击法,当细菌长到对数中期；冷却，离心；然后用冷却的去离子水反复清洗；最后用10%甘油重悬；超低温保存。,感受态细胞制备,转化,受电场强度、电脉冲长度和DNA浓度等参数的影响。电压和电脉冲长度增高，转化的细胞数量也有所提高，但存活率下降。电压：2.5 kv，电阻：300欧；电容：2.5 uF,12、大肠杆菌重组子筛选和检测,思考题,BamH Xba,EcoR I,BamH I,Xba I,PCR检测正确，片段已经整合进载体；用BamH和Xba切不出目的片段；,载体酶切位点在大肠杆菌中被甲基化；载体构建过程中出现星活性；,第三节 工程载体,植物基因转化载体必须具备的功能,能作为媒介将外源基因导入到植物细胞中，并整合到宿主细胞的基因组DNA上；能提供被寄主细胞的复制和转录系统识别的DNA序列，即启动子和复制子，以保证转化的外源基因能在植物细胞中进行复制和表达。,一、根瘤农杆菌Ti质粒载体,1、Ti质粒的遗传特性及类型,Ti质粒是根癌农杆菌染色体外的遗传物质，为双股共价闭合的环状DNA分子，约有200kb组成。,章鱼碱型(octopine)；胭脂碱型(nopaline)；农杆碱型(agropine)；农杆菌素碱型(agrocinoine)或称琥珀碱型。,根据其诱导的植物冠瘿瘤中合成的冠瘿碱种类的不同，Ti质粒可分成四种类型：,Agrobacterium tumefaciens,章鱼碱型(octopine),2.Ti质粒的功能区域,T-DNA区（transferred-DNA regions）：T-DNA是农杆菌侵染植物细胞时，从Ti质粒上切割下来转移到植物细胞的一段DNA，称为转移DNA。该DNA片段上的onc基因与肿瘤的形成有关。Vir区（virulence region）该区段上的基因能激活T-DNA转移，使农杆菌表现出毒性，故称之为毒区。T-DNA区与Vir区在质粒DNA上彼此相邻，约占Ti质粒DNA的三分之一。Con区（regions encoding conjugations）该区段上存在着与细菌间接合转移的有关基因（tra），调控Ti质粒在农杆菌之间的转移。冠瘿碱能激活tra基因，诱导Ti质粒转移，因此称之为接合转移编码区。Ori区（origin of replication）该区段基因调控Ti质粒的自我复制，故称之为复制起始区。,T-DNA区(transferred DNA regions),T-DNA：农杆菌侵染植物时，从Ti质粒上导入植物细胞的一段DNA。23kb左右，携带有致瘤基因和冠瘿碱合成酶基因；T-DNA区的致瘤基因是一些与激素合成有关的基因。这些基因的表达，破坏了植物体内正常的激素平衡，导致植物冠瘿廇的出现；T-DNA两端各有一高度同源的25bp的重复序列，分别称为左边界序列(LB)和右边界序列(RB)，对T-DNA转移到植物细胞至关重要(尤其是RB)。,Vir区的基因与T-DNA从细菌转移到植物细胞的遗传过程有关，能够使农杆菌表现出毒性；Vir区总长约35kb，包括7个基因，VirA、VirB、VirC、VirD、VirE、VirG、VirH；VirA：组成性表达；VirB、VirC、VirD、VirE：诱导性表达：VirG：受信号分子诱导后表达量提高10多倍；信号分子：乙酰丁香酮等。,Vir区(毒性区),植物细胞创伤信号（AS）结合并激活VirA，VirA转移磷酸基团激活VirG，形成二聚物，结合到Vir基因启动子区域，激活这些基因的表达。双因子调控体系。,毒性区对T-DNA的作用既可以顺式作用进行，也可以反式作用进行。两种情况下T-DNA都可在毒性区作用下转移并整合到植物基因组中；顺式作用：指T-DNA区与毒性区位于同一个Ti质粒上；反式作用：指T-DNA与毒性区不在同一Ti质粒上，而位于另一个相应的中间载体质粒上。,调控Ti质粒的自我复制。,Con区(接合转移编码区),具有在细菌间进行接合转移的有关基因(tra)，调控Ti质粒在农杆菌之间的转移。,Ori区(origin of replication),细菌吸收和利用冠瘿碱的区域，具有冠瘿碱分解酶基因如章鱼碱分解酶基因Occ。,冠瘿碱代谢区(opine catabolism),4、Ti质粒基因转化机理,农杆菌附着到植物细胞后，只留在细胞间隙中。,（1）T-DNA的加工及转移,下链25bp重复序列的右边界左起第3和第4碱基间缺口剪切，然后从缺口5端开始合成新的DNA链，并一直延伸到左边界第22碱基处，置换出原来的下链，形成ssDNA，即T链。,VirD:包含VirD1、VirD2、VirD3、VirD4。VirD1具有拓扑异构酶活性，将超螺旋DNA变为松弛DNA；VirD2具有核酸内切酶活性，切割双链DNA的一条链。C端有核定位信号。,VirC:包含VirC1和VirC2。为ATPase，对质粒DNA的准确剪切是必需的。,（2）T链复合物的形成,T链必须横向跨越细菌细胞膜、细菌细胞壁、植物细胞壁、植物细胞膜及核膜，才能整合进植物基因内。链必须避免被核酸降解，因此链可能以一种DNA-蛋白复合体形式存在。,VirD2从T-DNA的产生到整合到植物基因组整个过程，都与T-DNA共价结合在一起。VirE2编码ssDNA结合蛋白,与任何ssDNA结合。通达与链非共价结合，VirE2可包被T链,形成细长的核-蛋白丝,因而故VirE2不仅保护ssDNA,使ssDNA抗3和5外切核酸酶和内切核酸酶，而且T使链形变成一种可转运的形式。,（3）T链复合物的转运,形成跨膜孔道，需要跨膜或者膜结合蛋白的参与；VirB蛋白在膜上形成一种类似于细菌结合转移时从工体菌转至受体菌所必需的结构，即接合孔或性毛，T-DNA通过这种孔由细菌进入到植物细胞。同时VirB也可能起运输和提供能量的作用。,（4）T链复合体靶向植物细胞核,VirD2及VirE2上有核定位信号，但VirE2与VirD2相比，其核定位功能较弱。VirD2可能以一种极性方向，首先将T复合体定向至核孔，而virE2则作为一种促进因子，保证很长的T复合体在进入核孔时不受干扰。VirD2及VirE2蛋白上的核定位信号与动物相似，说明植物和动物的这种信号从进化上讲是保守的。,（5）T链整合到基因组,T-DNA在植物染色体中的插入是随机的。它可插入任何一条植物染色体。但插入位点常有以下特点：,T-DNA优先整合到转录活跃的植物基因位点；T-DNA与植物DNA连接处富含A，T碱基对；植物DNA上的插入靶位点与T-DNA边界序列有一定程度的同源性。,由于这种同源性才使得插入的T-DNA和靶序列能互相靠近，并有效地发生DNA链的交换。T-DNA的整合是异常重组的结果。T-DNA右未端在靶序列的识别及连接中是必需的，T-DNA左未端和两个靶DNA未端则参与部分配对和DNA修复。,T-DNA插入的遗传特性：T-DNA的插入不引起植物DNA大的重排。但多数插入会导致靶位点处小的缺失，缺失多至79个核苷酸。另一个常见的结果是，在T-DNA植物DNA连接处，会有几个至33个核苷酸的“填充”DNA（Filler DNA）存在，这些“填充”DNA的序列与靠近连接处的植物DNA序列相似。在植物靶位处不要求有特异的序列，但若在T-DNA两端和植物靶位处之间有一段短序列（510b）同源，则可以在整合中起作用。,4、Ti质粒的生物学功能,为农杆菌提供附着于植物细胞壁的能力；为寄主细胞合成植物激素IAA和细胞分裂素；诱发植物产生冠瘿瘤并决定所诱导的肿瘤的形态学特征和冠瘿碱成分；赋予寄主菌株分解代谢各种冠瘿碱的能力；赋予寄主菌株对土壤杆菌素的反应性；决定寄主菌株的植物寄主范围；抑制某些根瘤农杆菌噬菌体的生长和发育。,4、Ti质粒的改造,Ti质粒分子量过大，200kb左右，难以操作；分布着各种限制酶的多个切点，难以找到可利用的单一限制性内切酶位点；T-DNA区Onc基因的产物干扰宿主植物中内源激素的平衡，诱发肿瘤，阻碍细胞的分化和植株的再生；Ti质粒不能在大肠杆菌中复制,即使得到重组质粒，也只能在农杆菌中进行扩增；而农杆菌的转化率极低（10左右）拷贝数少；Ti质粒上还存在一些对于T-DNA转移不起任何作用的序列。,野生型Ti质粒直接作为植物基因工程载体，存在如下障碍：,一元载体和双元载体,酶切连接系统,同源重组系统,Gateway克隆技术是利用噬菌体与大肠杆菌的染色体之间发生的嗜菌体位点特异重组系统的重组整合与切出反应。创建Gateway克隆，通过PCR或传统的克隆方法将目的基因克隆进入门载体。混合包含目的基因的入门克隆和合适的目的载体及Gateway LR Clonase酶，产生表达克隆。（表达克隆用来在合适的宿主中进行蛋白的表达和分析。）Gateway技术也利用了ccdB选择方法，以确保高效率的分离重组克隆。典型的效率是95。,infusion重组系统,5、表达载体转化根癌农杆菌,感受态制备,CaCl2法：与大肠杆菌基本一致区别：菌液需加入抗生素筛选；培养时间更长；培养温度28；超低温保存用甘油。,转化,转化农杆菌后如何进行酶切鉴定？,二、发根农杆菌Ri质粒载体,发根农杆菌与根癌农杆菌都能侵染植物细胞，但病症不同。,发根农杆菌侵染后植物细胞产生许多不定根。能够感染大多数双子叶植物和少数单子叶植物及裸子植物。,发根农杆菌同样具有与Ti质粒相似的称之为Ri的巨大质粒。,Ri质粒可以不用“解除武装”进行转化，产生的发根能够再生；发状根是单细胞克隆，避免产生嵌合体；可直接作为中间载体；发根适于离体培养，离体培养次生代谢产物合成能力更强。,根据转化植物后产生的毛状根合成冠瘿碱的类型不同，分为：甘露碱型、黄瓜碱型和农杆碱型。,从发展植物基因工程载体考虑，Ri质粒是颇有吸引力的。这是因为在不同的双子叶植物中，由Ri质粒诱发产生的合成冠瘿碱不定根组织，经过培养基中的植物激素的刺激作用，都可再生成可育的完整的植株。解释Ti质粒载体的许多概念对于Ri质粒载体也是适用的。现在已发展出了Ri质粒载体的共合体系,三、植物病毒载体,植物病毒及其它的一些病原体，是一类能够在感染的植物寄主细胞中进行复制和表达的“外来的”核酸类型。以植物病毒作为植物基因工程的克隆载体具有的优点。有一部分植物病毒对寄主的感染是系统性的，它能够将其基因组扩散到被感染植株的所有细胞。植物病毒载体，如双子座病毒组病毒由于具有广泛的寄主范围，存在着被发展作为单子叶植物基因克隆载体的潜力。被感染的植株能够繁殖出大量的病毒颗粒。类型：单链的RNA植物病毒、单链的DNA植物病毒和双链的DNA植物病毒。,1、单链的RNA植物病毒,90以上的植物病毒的遗传物质，都是具有感染性的正链RNA。,反转录酶和DNA聚合酶，将单链的病毒 RNA转变成双链的 DNA；然后把这种 DNA克隆到一种原核生物的质粒或柯斯质粒载体上；在形成的重组质粒分子中，外源基因是插入在dcDNA部分；将带有外源基因的病毒载体重新导入植物寄主细胞。,2、单链植物DNA病毒载体,3、双链DNA植物病毒载体,花椰菜花叶病毒组和黄瓜脉病毒组,将目的基因插入到CaMV DNA上特定的非功能区域，不影响病毒基因组的侵染性。CaMV侵染植物以后复制在寄主核内；目的基因不能整合到染色体上，但是可以稳定表达；基因组35S启动子可在植物细胞内高效表达，可用于基因过表达。,局限性：容纳外源基因能力有限，寄主范围也有限；感染后寄主植物易患病，产量品质下降；不能感染整个植株，需通过原生质体克服。,第四节 标记基因,选择标记基因(selectable marker gene)：编码产物能使转化的细胞、组织具有对抗生素、除草剂的抗性或代谢的优越性，从而将转化的细胞、组织筛选出来的一类基因；报告基因(reporter gene)：编码产物能够被快速测定，用来判断外源基因是否已成功导入受体细胞、组织，并检测其表达活性的一类基因；,报告基因实质上起到了标记基因的作用，故当其被用来区分转化细胞时,也可将其称为标记基因。,1 标记基因和报告基因的构建,标记基因：与适当的组成型启动子构成嵌合基因，克隆在质粒载体上，导入受体细胞内；报告基因：将其编码区与位于其上游或下游的目的基因融合，置于目的基因启动子的控制之下,克隆到质粒载体上，导入细胞内。,2 转基因植物常用的标记基因,编码正常植物细胞中不存在的产物；基因较小，易构成嵌合基因；能在转化体中得到充分表达；容易检测，并能定量分析。,选择标记基因应具备的特征,常用的选择标记基因,抗生素抗性基因：npt(新霉素磷酸转移酶),hpt(潮霉素磷酸转移酶),cat(氯霉素乙酰转移酶)等；除草剂抗性基因：pat(抗磷化麦黄酮),sul(抗磺胺类除草剂),epsps(抗草甘膦)；糖代谢途径相关基因：pmi(6-磷酸甘露糖异构酶)激素代谢途径相关基因：ipt(异戊烯基转移酶),iaah(吲哚乙酰胺水解酶),dhfr(二氢叶酸还原酶)。,3 转基因植物常用的报告基因,已被克隆，全序列已测定；表达产物在受体细胞中不存在，也无相似的内源性表达产物，且对受体细胞无毒；表达产物能进行定量测定。,报告基因应具备的特征,-葡萄糖酸苷酶基因(gus),萤光素酶基因(luc),绿色荧光蛋白基因(gfp)等。,常用的报告基因,Gus基因的检测,Gus：来源于细菌，催化葡萄糖苷酯类物质的水解。绝大多数植物细胞不存在内源的GUS活性，因而被广泛用作转基因植物的报告基因；常用底物有3种，分别用于不同的检测方法。(1)组织化学染色法：5溴4氯3吲哚D葡萄糖苷酸酯，XGluc；(2)荧光法：4甲基伞形酮酰D葡萄糖醛酸苷酯，4MUG；(3)分光光度计法：对硝基苯D葡萄糖醛酸苷，PNPG。,组织化学染色法,以X-Gluc为底物，通过显色反应直接观察组织器官中GUS酶活性，具有GUS活性部位呈蓝色；定性测定。,荧光法测定,以4-MUG为底物，催化产生荧光物4-甲基伞形花酮(4-MU)及-D-葡萄糖醛酸，4-MU可被365nm的光激光，产生455nm的荧光。,分光光度计法,以PNPG为底物，水解后产生对硝基苯酚。在pH 7.15时离子化的发色基团吸收400-420nm的光，溶液呈黄色；定量测定。,第五节 常见功能载体,1、互补验证载体,将野生型中该基因的启动子+基因组DNA+下游终止序列一起连接到载体，转入到突变体中。,2、过表达载体,ATG,TAA,CDS,3、干涉载体,HPT,pUBI,p35S TNOS,AAT GTA,MCS,反向载体,干涉载体,HPT,pUBI,p35S TNOS,intron,病毒介导,WT anti-1 anti-2 anti-3 anti-4,4、表达模式,启动子 GUS,5、亚细胞定位,GFP融合在3端与融合在5端有什么区别？,GFP融合在3端：去终止密码，读码框不能移位,6、原核表达,7、酵母双杂交,The End!,