实验四酸性磷酸酶Km及Vmax值测定.ppt

酸性磷酸酶Km及Vmax值测定清洗试管24支,酸性磷酸酶：催化磷酸单酯的水解反应 存在于人的肝脏，前列腺等处 植物中以发芽的种子中含量最为丰富。是生物体中重要的一种酶类，为某些疾病的检测指标。,一、概述,酶液 磷酸苯二钠 苯酚 磷酸氢二钠 folin-酚测定酚的浓度 计算出反应速度（用产物生成量/min来表示）根据双倒数法计算出Km及Vmax,二、实验原理,三、实验步骤：1、豆芽中的酸性磷酸酶的粗提取2、制作酶反应时间与产物生成量的关系曲线3、制作酚标准曲线 4、S与V0关系实验 5、双倒数作图法计算Vmax和Km,buffer,substrate,enzyme,Certain Time,blank,Stop the reaction,Color developed,生化实验课老师：于晓虹实验报告请交到讲台上来酶液稀释取上清液微升，稀释倍，用大试管装科代表李博恒,1、磷酸酶原液的制备：称取5g绿豆芽茎（去头去根），加入pH5.6的HAC缓冲液2ml研磨成浆并静置30分钟。纱布过滤，取1.8ml滤液,以6000rpm，离心20min，取上清。上清液用pH 5.6的HAC缓冲液稀释30倍，用于实验。,2、制作酶反应时间与产物生成量的关系曲线（目的：选取合适的反应时间）,加 液 程 序 表管号 1 2 3 4 5 6 0磷酸苯二钠 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5酶液 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5精确反应时间 3 5 10 15 20 25 碳酸钠溶液 2 2 2 2 2 2 2 酶液 0.5Folin酚溶液 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 Folin酚溶液已稀释好！注：进行酶促反应时，注意预热，使所有的反应在同等条件下开始,35保温10分钟,结果：,以反应时间为横坐标，A680nm为纵坐标，绘制反应进程曲线，并从该曲线上求出酸性磷酸酶反应初速率的时间范围。,3、制作酚标准曲线（目的：可从酚标准曲线上查出A680nm所相当的酚含量,并计算出反应速度（用每分钟产物生成量来表示）,加 液 程 序 表,35保温10分钟,结果：,以酚含量（mol）为横坐标，A680nm为纵坐标，绘制标准曲线。,以0号管作空白，在可见光分光光度计680 nm波长处读取各管的吸光度（A680nm）。,4、S与V0关系实验,实 验 加 液 程 序 表管号 1 2 3 4 5 6 0磷酸苯二钠 0.10 0.15 0.20 0.25 0.30 0.50 0.50 醋酸缓冲液 0.40 0.35 0.30 0.25 0.20-酶液 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50-精 确 反 应 15 分 钟 35度碳酸钠溶液 2 2 2 2 2 2 2 Folin酚溶液 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 酶液 0.5 35保温10分钟测680nm处吸光度 注：进行酶促反应时，注意预热，使所有的反应在同等条件下开始,实验中需注意事项：酶反应作用时间精确控制,实验结果,1、酚含量从酚标准曲线上查得2、V0 反应初速率（mol/min）为酚含量除以酶反应时间（15分钟）。3、双倒数作图法计算Vmax和Km,