实验三酵母核糖核酸(RNA)的提取.ppt

实验三 酵母菌RNA的提取、鉴定及定量测定,一、实验目的,掌握稀碱（NaOH）法分离酵母RNA的原理与方法了解RNA的组分并掌握定性鉴定的具体方法。,二、实验原理,（一）目前常用的RNA的制备方法浓盐法：是用高浓度盐溶液处理，同时加热，以改变细胞壁的通透性，使核酸从细胞内释放出来。成本低、适于大规模操作。稀碱法:是用氢氧化钠使酵母细胞壁变性、裂解，然后用酸中和，除去蛋白质和菌体后的上清液用乙醇沉淀RNA。提取的RNA有不同程度的降解。稀碱法的提取时间短，提取率高于浓盐法，更利于工业化生产。,（二）实验材料的选择,酵母细胞富含核酸，且核酸主要是RNA，含量为干菌体的2.67%-10.0%，而DNA含量较少，仅为0.03%-0.516%。为此提取RNA多以酵母为原料。,（三）RNA的化学组成的鉴定,（1）嘌呤碱鉴定：与硝酸银作用产生白色的嘌呤银化合物沉淀。（2）核糖的鉴定：地衣酚（3,5二羟甲苯试剂）显色法（3）磷酸的鉴定：与钼酸铵试剂作用产生黄色的磷钼酸铵沉淀(NH4)3PO412MoO3。（4）脱氧核糖的鉴定：与二苯胺试剂反应生成蓝灰色沉淀，如没有沉淀产生，说明没有DNA.,三、试剂,1.干酵母粉。20.04mol氢氧化钠溶液。3乙酸。495乙醇。55硫酸。6.浓氨水。7.50g/L硝酸银溶液。,8地衣酚（3,5二羟甲苯试剂）：取比重1.19HCl 100ml，加入FeCl36H20 100mg及二羟甲苯100mg，混匀溶解后，置于棕色瓶中，此试剂必须在临用前新鲜配制。市售的3,5二羟甲苯不能使用，必须用苯纯化结晶l2次，并用活性炭脱色方可使用。9定磷试剂：2.5钼酸铵溶液：20ml水溶解2.5克钼酸铵，加5molL H2S0430ml，用水稀释至l00ml，此试剂可在冷处保存一月不变质。,10.10抗坏血酸(Vc)溶液：10g抗坏血酸溶于100ml水。贮棕色瓶中。溶液呈淡黄色尚可用，如呈深黄色即失效。11二苯胺试剂：称取1.5g二苯胺（如不纯，须在70乙醇中重结晶2次），溶于100ml冰醋酸（AR）中，再加入浓H2SO41.5ml，摇匀，贮在棕色瓶中放冰箱内保存备用。12沉淀剂(钼酸铵过氯酸试剂)：0.25钼酸铵溶于2.5过氯酸中。如配200ml，即在 193ml水中加入7m170过氯酸和0.5g钼酸铵。,四、操作步骤,1.核酸的提取：每二人用大试管取1g干酵母,加入0.05mol NaOH溶液5ml提取，放入试管沸水浴加热30分钟，并经常搅拌。待冷却后加入乙酸58滴，使提取液呈酸性(石蕊试纸)，移在离心管里，离心10分钟(3500转分)。将上清液倒入另一离心管中，加入95乙醇2ml，边加边搅。加毕，离心10分钟，即可得到核酸钠的白色沉淀。,2.核酸的水解：在含有核酸钠的离心管中加入5硫酸2ml，用玻棒搅匀，沸水浴煮10分钟。其中1ml水解液放进EP管里，贴好标签冷冻保存（下次试验用）,3.核酸的鉴定 取水解液，按下表所列程序分别鉴定核酸的嘌呤碱、磷酸及核糖和脱氧核糖。,1.嘌呤碱的鉴定：取试管两只，分别标明测定管与对照管，依次加入下列各试剂。,注：加浓氨水使呈碱性可用pH 试纸检定。加入AgNO3后，观察有何变化。静置15分钟后，再比较两管中之沉淀。,2.磷酸的鉴定：取试管两只，分别标明测定管与对照管，然后依次加入下列各试剂：,放置数分钟，观察两管颜色有何不同。磷酸+钼酸铵磷钼酸+Vc钼蓝,3.核糖的鉴定：取试管两只，分别标明测定管与对照管，然后依次加入下列各试剂。,将两试管放入沸水浴内加热10分钟，比较两管之颜色。,4.脱氧核糖的鉴定：取两试管分别标明测定管与对照管，然后依次加入下列各试剂。,将两试管同时放入沸水浴内，加热10分钟后，比较两管之颜色。,思考题,1.核酸的溶解性质是什么?常用什么试剂分离沉淀核酸?2.为什么用酵母作为实验原料？如何使RNA从酵母中释放出来？3.破酵母细胞时为什么要在沸水浴中进行?,实验五 RNA的定量测定紫外(UV)吸收法,一、目的要求,1.掌握紫外线（UV）吸收法测定核酸浓度的原理。2.熟悉紫外分光光度计的使用方法。,二、实验原理,核酸及其衍生物，核苷酸、核苷、嘌呤和嘧啶有吸收UV的性质，其吸收高峰在260nm波长处。测得未知浓度核酸溶液的A260nm值，即可以计算出其中RNA或DNA的含量。该法操作简便，迅速，并对被测样品无损，用量也少。,三、试剂,钼酸铵过氯酸沉淀剂：取3.6ml 70%过氯酸和0.25g钼酸铵溶于96.4ml蒸馏水中，即成0.25%钼酸铵2.5%过氯酸溶液。,四、操作步骤,（1）取0.5ml未知浓度的RNA溶液（上次实验提取），用蒸馏水稀释至50ml，此为A液。（2）取A液2ml，再稀释至50ml，为B液。（3）另取4ml A液，加1ml沉淀剂，摇匀后置冰水中20分钟，离心（3500rpm/min，10分钟），取上清液2.5ml，稀释至50ml，此为C液。沉淀剂的作用是，使RNA沉淀析出，得到不含RNA的对照液。（4）分别取B，C液于厚度为1cm的石英比色杯，在260nm波长处测定A值。,式中A260为B管稀释液在260nm波长处A值减去C管稀释液在260nm波长处A值。N为稀释倍数.0.024（或0.020）表示1mg/ml RNA（或DNA）溶液测定的A260值相当于0.024。此为多次试验验证的数值。,计算,1000,思考题,1.核酸的溶解性质是什么?常用什么试剂分离沉淀核酸?2.为什么用酵母作为实验原料？如何使RNA从酵母中释放出来？3.破酵母细胞时为什么要在沸水浴中进行?,实验六 过氧化氢酶米氏常数（Km）的测定,一、实验目的,学习米氏常数的测定方法。,二、实验原理米氏常数的测定,米氏常数的测定：双倒数作图法（Lineweaver-Burk法）,1 Km 1 1=.+v Vmax S Vmax,二、实验原理,本实验测定红细胞中过氧化氢酶的米氏常数。过氧化氢酶(CAT)催化下列反应：2H2O2 CAT 2H2O+O2 H2O2浓度可用KMnO4在硫酸存在下滴定测知。2KMnO45H2O23H2SO4-2MnSO4K2SO45O28H2O 求出反应前后H2O2的浓度差即为反应速度。作图求出过氧化氢酶的米氏常数。,三、试剂,10.05mol/L草酸钠标准液 将草酸钠（AR）于100105烘12h。冷却后，准确称取0.67g，用水溶解倒入100ml量瓶中，加入浓H2SO4 5ml，加蒸馏水至刻度，充分混匀，此液可贮存数周。2约0.02ml KMnO4储存液 称取KMnO4 3.5g，溶于1000ml蒸馏水中，加热搅拌，待全部溶解后，用表面皿盖住，在低于沸点温度上加热数小时，冷后放置过夜，玻璃丝过滤，棕色瓶内保存。30.004mol/L KMnO4应用液 取0.05mol/L草酸钠标准液20ml，于锥形瓶中，加浓H2SO4 4ml，于70水浴中用KMnO4贮存液滴定至微红色，根据滴定结果算出KMnO4贮存液的标准浓度，稀释成0.004mol/L，每次稀释都必须重新标定储存液。4约0.08mol/L H2O2液 取20%H2O2（AR）40ml于1000.0ml量瓶中，加蒸馏水至刻度，临用时用0.004mol/L KMnO4标定之，稀释至所需浓度。50.2mol/L磷酸盐缓冲液（pH7.0）。,四、操作步骤,l血液稀释：吸取新鲜（或肝素抗凝）血液0.1ml，用蒸馏水稀释至10ml，混匀。取此稀释血液1.0ml，用磷酸盐缓冲液(pH7.0，0.2mol/L)稀释至10ml，得1：1000稀释血液。2H2O2浓度的标定：取洁净锥形瓶两只，加浓度约为0.08mol/L的H2O2 2.0ml和25%H2SO4 2.0ml，分别用0.004mol/L KMnO4滴定至微红色。从滴定用去KMnO4 ml数，求出H2O2的 mol浓度。,3反应速度的测定：取干燥洁净50ml锥形瓶5只，编号，按下表操作。将各瓶置37水浴预热5min，依次加入1：1000稀释血液每瓶0.5ml，边加边摇，继续保温准5min，按顺序向各瓶加25%H2SO4 2.0ml，边加边摇，使酶促反应立即终止。最后用0.004mol/L KMnO4滴定各瓶至微红色,记录KMnO4消耗量(ml)。,五、计算,1（式中：4为反应液量4ml）2反应速度的计算：以反应消耗的H2O2 mmol数表示。反应速度=加入的H2O2 mmol数剩余的H2O2 mmol数剩余的H2O2 mmol数：KMnO4 0.005 mol/L消耗的KMnO4毫升数 5/2（式中：5/2为KMnO4与H2O2反应中mol换算系数）3求Km值：实验测得的结果，以1/v对1/S作图，求出V和Km的数值。,0.004,实验七 维生素C的定量测定 2.6-DCPIP（2.6-二氯酚靛酚）滴定法,一、实验目的,1.学习并掌握定量测量维生素C的原理和方法。2.熟练微量滴定法的基本操作。,二、实验原理,维生素C是人类营养中最重要的维生素之一，根据它具有的还原性质可以测定维生素C的含量。常用的测定方法有（1）2，6-DCPIP(Dichlorophenolindo phenol)（还原型VC）（2）2，4-二硝基苯肼法（总VC）（3）碘酸法（4）碘量法（5）荧光分光光度法,三、试剂及仪器,（一）试剂及材料（1）松针（2）酸化蒸馏水（3）2，6DCPIP；将50mg2，6DCPIP溶解于约200ml含有52mg碳酸氢钠的热水中。冷后稀释至250ml。装入棕色瓶内。放在 冰箱里保存。2，6DCPIP不稳定,每周必须重新配制，使用前需按照下法标定：取5ml标准抗坏血酸溶液加5ml1草酸，以2，6DCPIP滴定呈粉红色，并在15秒钟内不退色为终点。计算2，6DCPIP溶液的浓度。（4）标准抗坏血酸溶液：溶解100mg纯抗坏血酸粉状结晶于1草酸中，然后稀释到500ml。使用前临时配制。（二）器材（1）锥形瓶（50ml）（2）小研钵（3）吸量管（10ml）（4）漏斗（5）滤纸（6）容量瓶（50ml）（7）微量滴定管（5ml）,四、操作步骤,1.准确称取松针约1g。样品必须用温水洗去泥土，并在空气中风干。放入研钵中，加1g石英砂，再加酸化蒸馏水510ml一起研磨。2.离心（3500转/分）10分钟，将上清液移入容量瓶，用酸化蒸馏水定容至50ml。3.取10ml上述溶液放入小锥形瓶内，用微量滴定管，以2，6DCPIP（蓝色）滴定至提取液呈现淡粉红色，并保持1530秒不褪。(滴定过程必须迅速，不要超过2min。因为在本滴定条件下，一些非维生素C还原物质的还原作用较迟缓，快速滴定右以避免或减少它们的影响)4.另取10ml酸化蒸馏水作空白对照滴定。提取液和空白对照各做三份，对结果取平均值进行计算,五、计算,式中：VA为滴定样品提取液所耗用的2，6DCPIP的平均毫升数；VB为滴定空白对照所耗用的2，6DCPIP的平均毫升数；C为样品提取液的总毫升数；D为滴定时所取的样品提取液毫升数；W为被检样品的质量。T为1ml标准0.001N 2，6DCPIP溶液相当维生素C的毫克数，T的具体数目为0.088mg/ml。,思考题为了准确测得维生素C含量，实验过程中都应注意哪些操作步骤？为什么？,实验八 血糖的定量测定（GOD-PAP法）,一、实验目的,学习GOD-PAP法测定血糖含量的原理和方法。,二、实验原理,动物血液中的糖主要是葡萄糖，正常情况下，其含量较恒定。健康动物血糖水平为80-120mg/100ml。GOD-PAP法，即过氧化物酶-抗过氧化物酶法是近几年临床血糖定量测定的普遍方法。该法测定血糖依据的酶反应为：葡萄糖+O2+H2O=葡萄糖酸+H2O2 2H2O2+4-氨基安替比林+酚=醌亚胺+4H2O醌亚胺在A480nm-A550nm波长有最大吸收，所产生颜色的深浅与血清中葡萄糖的量成正比。在同样条件下，测定葡萄糖标准液和样品的吸收值，代入后面所给公式即可求出样品中葡萄糖的含量。,三、试剂及仪器,1.血糖试剂盒 酶试剂（GOD，PAP，磷酸盐，酚，4-氨基安替比林）100mg/dL血糖标准溶液 2.兔血清,四、操作步骤,取3只试管，按下列加入试剂 空白 标准 样品酶制剂 3.00ml 3.00ml 3.00ml蒸馏水 0.02ml-葡萄糖标准溶液-0.02ml-样品-0.02ml分别将各管溶液摇匀，37度保温15分钟，505nm波长比色。,五、计算,C样品=(A样品/A标准)x C标准,实验九 小麦萌发前后淀粉酶活力的比较,一、实验目的,1学习分光光度计的原理和使用方法。2学习测定淀粉酶活力的方法。3了解小麦萌发前后淀粉酶活力的变化。,二、实验原理,种子中贮藏的碳水化合物主要以淀粉的形式存在。种子萌发时，淀粉酶活性随萌发时间迅速增加，将淀粉分解成小分子糖类，供幼苗生长。淀粉的水解产物麦芽糖有还原性,能与3,5-二硝基水杨酸试剂反应，使其还原生成红色3-氨基-5-硝基水杨酸。在一定范围内，其颜色深浅与淀粉酶水解产物的浓度成正比，可用麦芽糖（或葡萄糖）浓度表示，用比色法测定淀粉生成的还原糖的量，以单位重量样品在一定时间内生成的麦芽糖的量表示酶活力。,三、试剂及仪器,（一）器材125毫升刻度试管。2吸管。3乳体。4离心管。5分光光度计。6离心机。7恒温水浴。（二）试剂1.0.1标准麦芽糖溶液 20毫升：精确称量100毫克麦芽糖，用少量水溶解后，移入100ml容量瓶中，加蒸馏水至刻度。2pH 6.9，0.02摩尔L磷酸缓冲液 100毫升3l淀粉溶液100毫升：1克可溶性淀粉溶于100毫升 0.02摩尔L磷酸缓冲液，其中含有 0.006摩尔L氯化钠。4l3,5-二硝基水杨酸试剂:1g 3,5-二硝基水杨酸溶于20毫升2摩尔L的氢氧化钠溶液和50毫升水中；再加人30克酒石酸钾钠，定客至100毫升。若溶液混浊，可过滤。5l氯化钠溶液300毫升,四、操作步骤,1种子发芽：小麦种子浸泡2.5小时后，放人25恒温箱内或在室温下发芽。2酶液提取：取发芽第三天或第四天的幼苗15株，放人乳钵内，加海砂 0.2g，加 1NaCI溶液10毫升，用力磨碎。在室温下放置 20分钟，搅拌几次。将提取液离心（l500转min）10分钟。将上清液倒人量筒，测定酶提取液的总体积。进行酶活力测定时，将酶提取液稀释10倍。取干燥种子15粒作为对照（提取步骤同上）。,四、操作步骤,3酶活力测定：（1）取25毫升刻度试管4支。编号。按下表要求加人各试剂（各试剂须25预热10分钟）。将各管混匀，放在25，水浴中保温3分钟后，立即向各管中加人13,5-二硝基水杨酸溶液2毫升。（2）取出各试管，放人沸水浴中加热5分钟。冷至室温，加水稀释至25毫升。将各管充分混匀。（3）用空白管作对照；在500nm处测定各管的光吸收值.,五、计算,根据溶液的浓度与光吸收值成正比的关系，即：A标准A未知C标准C未知则 CA酶C标准A标准总活力单位=C酶N酶V酶N为酶液的稀释倍数V为测量后酶液的总体,