培养基成分及配制.ppt
2023/6/27,1,第三章 培养基及一般操作技术,2023/6/27,2,第一节 培养基的概念、种类和成分,第二节 培养基制备,第三节 一般操作技术,在离体培养条件下，不同种植物的组织对营养有不同的要求，甚至同一种植物不同部位的组织对营养的要求也不相同，只有满足了它们各自的特殊要求，它们才能很好地生长。因此，没有一种培养基能够适合一切类型的植物组织或器官。,2023/6/27,3,第一节 培养基的概念、种类和成分,一、概念：培养基（culture medium）是人工配制的含有各种营养成分，经过严格灭菌的适于植物生长重要基质。,在建立一项新的培养系统时，首先必须找到一合适的培养基，培养才有可能成功。在植物组织培养历史进程中，事实上也紧密地伴随着培养基的研制史。,2023/6/27,4,2023/6/27,5,不同的植物不同培养部位 不同的培养目的,需选用不同的培养基,二、培养基的种类,培养基多数以发明人的名字来命名，如White培养基，Murashige和Skoog培养基(简称MS培养基)，也有对某些成分进行改良称作改良培养基。,2023/6/27,6,培养基种类,MS培养基1962,B5培养基1968,White培养基1937,N6培养基1975,KM-8P培养基1974,Miller培养基1965,Nitsch培养基1963,WPM培养基1933,1962年由Murashige和Skoog为培养烟草细胞而设计的。特点：无机盐离子 浓度高，硝酸盐含量较高 广泛用于植物的器官、花药、细胞和原生质体培养,2023/6/27,7,MS培养基及特点:,1968年由Gamborg等为培养大豆根细胞而设计的。特点：含有较低的铵，这可能对不少培养物的生长有抑 制作用。双子叶植物 尤其木本植物组培可选择,2023/6/27,8,B5 培养基及特点：,1937年由White为培养番茄根尖而设计的，1943年 随其专著的出版而问世。1963年又作了改良，称作White改良培养基，提高了MgSO4的浓度和增加了硼素。,2023/6/27,9,White 培养基特点：,特点：无机盐数量较低适于生根培养,1974年朱至清等为水稻等禾谷类作物花药培养而设计的,2023/6/27,10,N6培养基特点：,特点;成分较简单，KNO3 和(NH4)2SO4含量高 适合花药培养,特点：有机成分较复杂，它包括了所有的单糖和维生素 广泛用于原生质体培养，包括融合的培养,2023/6/27,11,KM-8P培养基特点：,1974年为原生质体培养而设计的。,2023/6/27,12,培养基种类,固体培养基,液体培养基,通气性较好，便于操作，但营养分布不均，生长发育不整齐。,营养分布均匀，生长整齐一致，但通气性差。,培养基按是否加入凝固剂分为,2023/6/27,13,培养基成分,三、培养基的成分,水,无机盐,有机物,植物激素,培养体的支持材料,其它辅助性物质,水是植物原生质体的组成成分，也是一切代谢过程的介质和溶媒。它是生命活动过程中不可缺少的物质。配制培养基母液时要用蒸馏水，以保持母液及培养基成分的精确性，防止储藏过程发霉变质。大规模生产时可用自来水。但在少量研究上尽量用蒸馏水，以防成分的变化引起不良效果。,2023/6/27,14,（一）水,无机营养成分就是人们平常所说的矿物质、无机盐或无机元素。它们在植物生活中具有非常重要的作用。如氮（N）、硫（S）、磷（P）是蛋白质、氨基酸、核酸和许多生物催化剂即酶的主要或重要组分。它们与蛋白质、氨基酸、核酸和酶的结构、功能、活性等有直接的不可缺少的关系。,2023/6/27,15,（二）无机元素,根据植物对这些元素需要量的不同或者根据目前植物培养基中添加的这些元素量的大小，可将它们分成大量元素和微量元素。大量元素：一般指在培养基中的浓度大于0.5mmol/L的元素（或100mg/L）。主要包括氮、磷、钾、钙、镁和硫六种。微量元素：指小于0.5mmol/L的元素或100mg/L）。,2023/6/27,16,大量元素（以Ms培养基为例）,微量元素（以MS培养基为例）,1.大量元素,(1)N:是蛋白质、酶、叶绿素、维生素、核酸、磷脂、生物碱等的组成成分，是生命不可缺少的物质。在制备培养基时以硝态氮（NO3-N)或氨态氮（NH4-N)两种形式供应。大多数培养基既含有硝态氮（NO3-)又含有氨态氮（NH4+)。氨态氮（NH4-N)对植物生长较为有利。供应的物质有KNO3、NH4NO3等。有时，也添加氨基酸来补充氮素。缺氮时某些植物的愈伤组织会出现一种很引人注目的花色素苷的颜色，愈伤组织内部不能形成导管。,2023/6/27,19,(2)P 是磷脂的主要成分，而磷脂又是原生质、细胞核的重要组成部分。磷也是ATP、ADP等的组成成分。在植物组织培养过程中，向培养基内添加磷，不仅增加养分、提供能量，而且也促进对N的吸收，增加蛋白质在植物体中的积累。常用的物质有KH2P04或NaH2P04等。缺磷或钾时细胞会过度生长，愈伤组织表现出极其蓬松状态。,2023/6/27,20,(3)K 对碳水化合物合成、转移、以及氮素代谢等有密切关系。K增加时，蛋白质合成增加，维管束、纤维组织发达，对胚的分化有促进作用。但浓度不易过大，一般为1-3mgL为好。制备培养基时，常以KCl、KNO3等盐类形式提供。,2023/6/27,21,(4)Mg、S和Ca Mg 是叶绿素的组成成分，又是激酶的活化剂；S是含S氨基酸和蛋白质的组成成分。常以MgS047H20提供，用量为1-3mgL较为适宜；Ca是构成细胞壁的一种成分，Ca对细胞分裂、保护质 膜不受破坏有显著作用 常以CaCl22H20提供，缺硫时培养的植物组织会明显的退绿。,2023/6/27,22,2.微量元素,微量元素 包括Fe、Mn、Cu、Zn、Cl、B、Mo、Co等。铁是一些酶（氧化酶、细胞色素氧化酶、过氧化氢酶等）的重要组成成分，又是叶绿素形成的必要条件 培养基中的铁对胚的形成、芽的分化和幼苗转绿有促进作用 但由于Fe的特殊性质，即很不稳定、易沉淀，需要在酸性条件下才能比较稳定，故在培养基配制时常常把Fe盐单独配制，且以螯合物的形式存在,2023/6/27,23,B，Mn，Zn，Cu，Mo，Co等，也是植物组织培养中不可缺少的元素，缺少这些物质会导致生长，发育异常现象。Mn对糖酵解中的某些酶有活化作用，是三羧酸循环中某些酶和硝酸还原酶的活化剂。B 能促进糖的过膜运输，影响植物的有性生殖如花器官的发育和受精作用。B还具有抑制有毒的酚类化合物的形成的作用，改善某些植物组织的培养状况，缺硼时细胞分裂停滞，愈伤表现出老化现象。,2023/6/27,24,Zn 是吲哚乙酸生物合成必需的，也是谷氨酸脱氢酶、乙醇脱氢酶等的活化剂。Cu 是细胞色素氧化酶、多酚氧化酶等氧化酶的成分，可影响氧化还原过程。Mo 是硝酸还原酶和钼铁蛋白的金属成分。,2023/6/27,25,有机营养成分,2023/6/27,26,碳水化合物,维生素,氨基酸,肌醇,天然复合物,椰乳、水解酪蛋白、水解乳蛋白、酵母提取物、胰蛋白胨、西红柿汁、香蕉粉、橘子汁、可可汁,（三）有机元素,氨基酸和有机附加物（以MS培养基为例）,选用种类：蔗糖（或葡萄糖、果糖）等 蔗糖浓度：23%，胚培养为415%高压灭菌部分糖会分解；大生产时可用绵白糖 不同糖类对生长的影响不同。从各种糖对水稻根培养的影响来看，以葡萄糖效果最好，果糖和蔗糖相当，麦芽糖差一些。不同植物不同组织的糖类需要量也不同，实验时要根据配方规定按量称取，不能任意取量。,2023/6/27,28,1.碳水化合物,2023/6/27,29,种类：VB1(盐酸硫胺素):促愈伤组织产生，提高活力 VB6(盐酸吡哆醇):促根生长 Vpp(烟酸):与代谢和胚发育有关 Vc(抗坏血酸):防组织褐变 有时还使用生物素、叶酸、核黄素等。浓度：0.11.0mg/L,2.维生素(vitamin),3.肌醇（环己六醇）,2023/6/27,30,促进糖类物质的相互转化和活性物质作用的发挥促进愈伤组织生长以及胚状体和芽的形成对组织细胞繁殖、分化的促进作用使用浓度100 mg/L注：用量过多则促褐变,是很好的有机氮源，可直接被细胞吸收利用。培养基中最常用的氨基酸是甘氨酸，其他的如精氨酸、谷氨酸、谷酰胺、天冬氨酸、天冬酰胺、丙氨酸等也常用。,2023/6/27,31,4.氨基酸,为了特殊的培养目的，在一部分培养基中还添加了一些特殊成分，如水解酪蛋白，水解乳蛋白，酵母提取物，胰蛋白胨，椰乳，西红柿汁，香蕉粉，橘子汁，可可汁等天然复合物以及活性炭，渗透调节剂等。,2023/6/27,32,5.天然复合物,是椰子的液体胚乳。它是使用最多、效果最大的一种天然复合物。在愈伤组织和细胞培养中有促进作用。一般使用浓度在10-20,2023/6/27,33,1)椰乳,用黄熟的小香蕉，加入培养基后变为紫色。对pH值的缓冲作用大。主要在兰花的组织培养中应用，对发育有促进作用。浓度：150-200ml/l,2023/6/27,34,2)香蕉,去掉皮和芽后，加水煮30min，再经过过滤，取其滤液使用，用量为150-200gL 对pH值缓冲作用也大。添加后可得到健壮的植株。,2023/6/27,35,3)马铃薯,为蛋白质的水解物，主要成分为氨基酸（含有约20种氨基酸的混合物），使用浓度为100-200mgL 受酸和酶的作用易分解。,2023/6/27,36,4)水解酪蛋白或水解乳蛋白,酵母提取液(YE)(0.01-0.05)，主要成分为氨基酸和维生素类；麦芽提取液(001-05)苹果和番茄的果汁、黄瓜的果实、未熟玉米的胚乳等。,2023/6/27,37,5)其他,2023/6/27,38,(四)植物激素,植物激素是指自然状态下植物体内合成，并从产生处运送到别处，对生长发育产生显著作用的微量（1微摩尔/升以下）有机物。植物生长调节剂是指一些具有植物激素活性的人工合成的物质。,植物激素（植物生长调节剂）,1、生长素类：IAA，IBA，2，4-D，NAA等。2、细胞分裂素类：KT，6-BA，ZT等。3、赤霉素类；GA1-GA4，GA7，GA9，GA16，GA24，GA25等4、脱落酸：ABA5、乙烯,2023/6/27,40,植物生长调节物质,植物激素,植物生长调节剂,在植物组织培养中使用的生长调节物质主要有生长素类和细胞分裂素类两大类，少数培养基中还添加赤霉素GA3等,2023/6/27,41,1）种类IAANAAIBA2,4D 2）作用诱导愈伤组织形成和根分化，促进细胞分裂 和伸长生长。根对生长素最敏感，在极低浓度下L)就可促进生长，其次是茎和芽。3）浓度0.055mg/L 天然的生长素热稳定性差，高温高压或受光条件易被破坏。在植物体内也易受到体内酶的分解。组织培养中常用人工合成的生长素类物质,1、生长素类,IAA(吲哚乙酸)是天然存在的生长素，亦可人工合成，其活力较低，是生长素中活力最弱的激素，对器官形成的副作用小，高温高压易被破坏，也易被细胞中的IAA分解酶降解，受光也易分解。NAA(萘乙酸)在组织培养中的起动能力要比IAA高出3-4倍，且由于可大批量人工合成，耐高温高压，不易被分解破坏，所以应用较普遍。NAA和IBA广泛用于生根，并与细胞分裂素互作促进芽的增殖和生长。,2023/6/27,42,IBA(吲哚丁酸)是促进发根能力较强的生长调节物质。2,4-D(2,4-二氯苯氧乙酸)起动能力比IAA高10倍，特别在促进愈伤组织的形成上活力最高，但它强烈抑制芽的形成，影响器官的发育。适宜的用量范围较狭窄，过量常有毒效应。生长素配制可先用少量95酒精助溶。2,4-D可用0.1molL的NaOH或KOH助溶。生长素常配成1mg/ml的溶液贮于冰箱中备用。,2023/6/27,43,(2)GA(赤霉素)种类：有20多种，生理活性及作用的种类、部位、效应等各有不同。培养基中添加的是GA3。作用：促茎伸长，促胚发育成植株；打破休眠；特性：赤霉素溶于酒精，配制时可用少量95酒精助溶。赤霉素不耐热，高压灭菌后将有70-100失效，应当采用过滤灭菌法加入。,2023/6/27,44,(3)细胞分裂素类 这类激素是腺嘌呤的衍生物，包括6-BA、Kt(kinetin)、玉米素Ze等。其中Ze活性最强，但非常昂贵，常用的是6-BA。细胞分裂素使用浓度：0.05-10mgL。,2023/6/27,45,在培养基中添加细胞分裂素有三个作用：诱导芽的分化促进侧芽萌发生长。细胞分裂素与生长素相互作用，当组织内细胞分裂素生长素的比值高时，诱导愈伤组织或器官分化出不定芽。促进细胞分裂与扩大。细胞分裂素多用于诱导不定芽的分化、茎、苗的增殖，抑制根的分化。避免在生根培养时使用。,2023/6/27,46,1、琼脂(agar)作用：最好的固化剂。琼脂是一种由海藻中提取的高分子碳水化合物，本身并不提供任何营养。特性：溶解在热水中，成为溶胶，冷却至40即凝固为固体状凝胶。通常所说的“煮化”培养基，就是使琼脂溶解于90以上的热水。浓度：琼脂的用量在6-10gL之间，若浓度太高，培养基就会变得很硬，营养物质难以扩散到培养的组织中去。若浓度过低，凝固性不好。,2023/6/27,47,(五)、培养材料的支持物,(六)、其它辅助性物质,2023/6/27,48,1.抗生物质2.抗氧化物3.活性炭,种类：青霉素、链霉素、庆大霉素等 用量：5-20mgL 作用：防止菌类污染，减少培养中材料的损失。对于刚感染的组织材料，可向培养基中注入5-10的抗菌素。注意：抗生素各有其抑菌谱，要加以选择试用，也可两种抗生素混用。但是应当注意抗生素对植物组织的生长也有抑制作用，使用要慎重。,2023/6/27,49,1抗生物质,酚污染：植物组织在切割时会溢泌一些酚类物质，接触空气中的氧气后，自动氧化或由酶类催化氧化为相应的醌类，产生可见的茶色、褐色以致黑色。这些物质渗出细胞外就造成自身中毒，使培养的材料生长停顿，失去分化能力，最终变褐死亡。在木本，尤其是热带木本及少数草本植物中较为严重。,2023/6/27,50,2、抗氧化物,目前还没有彻底完善的办法，只能按不同的实际情况，加用一些药物，并适当降低培养温度、及时转移到新鲜培养基上等办法，使之有不同程度的缓解，当然像严格选择外植体部位、加大接种数量等也应一并考虑。,2023/6/27,51,抗酚类氧化常用的药剂有半胱氨酸及Vc 用量：50-200mgL的浓度 方法：洗涤刚切割的外植体 表面 或过滤灭菌后加入固体培养基的表层。其他抗氧化剂：二硫苏糖醇、谷胱甘肽、硫乙醇、及二乙基二硫氨基甲酸酯等。,2023/6/27,52,活性炭为木炭粉碎经加工形成的粉沫结构，有很强的吸附作用，可以吸附非极性物质和色素等大分子物质，包括琼脂中所含的杂质，培养物分泌的酚、醌类物质以及蔗糖在高压消毒时产生的5-羟甲基糖醛及激素等。,2023/6/27,53,3、活性炭,使用浓度通常为0.5-1mgL 作用吸附外植体产生的致死性褐化物（初代培养）促进新梢的形成和伸长（新梢增殖阶段），但其作用有一个阀值，一般为0.1-0.2。促进生根（通过减弱光照保护了IAA），由于根的生长加快，吸收能力增强，反过来又促进了茎、叶的生长。活性炭可降低玻璃苗的产生频率，使用浓度一般0.3。,2023/6/27,54,每毫克的活性炭能吸附100ng左右的生长调节物质，这说明只需要极少量的活性炭就可以完全吸附培养基中的调节物质。大量的活性炭加入会削弱琼脂的凝固能力，因此，在使用时要有其量的意识,使活性炭发挥其积极作用。,2023/6/27,55,活性炭具有副作用，研究表示,按性质分 基本培养基：MS、MT（Murashige and Tucher）White 完全培养基 基本培养基 其它成分（激素、有机物质等）,第二节 培养基的制备,一、合适培养基的选择合适培养基的选择：基本培养基；各种激素的浓度与配比MS 培养基适合于大多数双子叶植物；B5和N6 培养基适合于许多单子叶植物；White 培养基适合于根的培养。首先试用这些培养基进行初步实验，在基本培养基确定之后，进行不同种类激素浓度和激素间相互比例的配合试验。,2023/6/27,57,在植物组织培养工作中，通常先配制一系列母液，即贮备液。所谓母液是欲配制液的浓缩液，这样不但可以保证各物质成分的准确性及配制时的快速移取，而且还便于低温保藏。,2023/6/27,58,二、母液的配制,2023/6/27,59,称 量,母液分装,确定培养基,溶 解,定 容,贴标签,保存于冰箱,(一)母液配制流程图,2023/6/27,60,一般母液配成比所需浓度高10-100倍。母液配制时可分别配成大量元素、微量元素、铁盐、有机物和激素类等。母液配好后放入冰箱内低温保存，用时再按比例稀释。,(二)母液配制要求(以MS为例)：,具体要求：(1)大量元素母液 可配成浓度20倍母液。(2)微量元素母液 可配成浓度1000倍的母液。(3)铁盐母液 可配成100倍的母液，(4)有机物母液 可配成100倍的母液。(5)激素母液的配制 每种激素必须单独配成母液，浓度一般配成1mgml。用时根据需要取用。因为激素用量较少，一次可配成50ml或100ml。,2023/6/27,61,IAA、IBA、GA溶于少量的95的酒精 加水定容；NAA 热水或少量95的酒精 加水定容；2,4-D可用少量1mol NaOH溶解 加水定容；Kt和BA 少量1mol的HCI中 加水定容；玉米素 于少量95的酒精 加热水到一定浓度。配制好的母液瓶上应分别贴上标签，注明母液名称、配制倍数、日期及配1L培养基时应取的量。,2023/6/27,62,激素溶解方法：,Ms母液（储备液）的配制与保存,三、培养基的制备,2023/6/27,65,母液移取：一次性移取，不能吸进吸气球里，数量看准，不滴不漏，吹净为度。,2023/6/27,66,大量元素母液 取50ml 微量元素母液 取1ml 铁 盐母液 取 10ml 有机物母液 取10ml,培养基的配制,1、在洁净的不锈钢锅里放入750ml蒸馏水，加入所需要的琼脂和糖，加热熔化。2、加入储备液1，2，储备液2、各1，10，10，按需要量加入植物激素。3、用蒸馏水定容到1L。4、调pH值。pH一般5.85、培养基的分装。6、包扎。7、培养基的高压灭菌。,取蒸馏水定容到750ml取蔗糖2530g，琼脂78g。,2023/6/27,68,1.称取蔗糖、琼脂,2.培养基熬制：,2023/6/27,69,(1).将加入称好的蔗糖和琼脂培养液倒入铝锅中，边煮边搅拌，防止糊底。用旺火煮开，再用文火加热，直至琼脂全部融化。(2).加入各种储备液，定容至1L,摇晃使均匀。,3.调pH值：,2023/6/27,70,用0.1MNaOH或HCl调pH值 为5.8趁热分装，100ml的三角瓶约装入3040ml，25瓶/L，加盖封口。,培养基的灭菌,培养基应及时（24h以内）灭菌，防止变质。高温高压蒸汽灭菌：121，1.1Kg/c，15-20min，时间过长，培养基成分易变性失效 过滤灭菌：在高温高压下易分解的培养基和激素类,2023/6/27,72,培养基高压蒸汽灭菌所必需的最少时间,1.常见的培养基种类有哪些？各有何特点？专为什么材料的培养而设计的？2.培养基的成分主要包括有哪些？3.培养基中常用的植物激素有哪些？各有何作用？4.合适培养基的选择应考虑哪些方面？,2023/6/27,73,复习思考题,
