厌氧菌的培养方法.ppt
厌氧菌的培养方法,祁红兵,物理方法包括遮断空气法、煮沸法、真空法、空气置换法、气体喷射法或转管法等化学方法包括焦性没食子酸法、铁丝绒法、保险粉法等 生物学方法包括与需氧菌共生好氧法、燕麦发芽法等 混合法包括厌氧罐（袋）法、厌氧手套箱法或厌氧室法、空气置换铁丝绒法、空气置换钯粒法等。,1 液体培养基的厌氧培养法,培养基煮沸：驱气后置流水中急速冷却 添加还原剂：0.030.05L-盐酸半胱氨酸 0.010.02硫乙醇钠 0.51葡萄糖 0.1抗坏血酸 其它还原剂 添加琼脂,2 固体培养基的厌氧培养法,厌氧罐法 简易厌氧罐和厌氧袋法 钢丝绒法 焦性没食子酸法抽气换气厌氧培养法 生物好氧厌氧培养法 转管技术和气体喷射培养法 厌氧手套箱法（又称厌氧室法）,2.1 Gas-pak法,原理,气体发生袋：柠檬酸和碳酸氢钠 H2O CO2 硼氢化钠 H2O H2 触媒：钯粒 H2O 厌氧罐中的O2 厌氧指示剂,11111,厌氧指示剂,亚甲基兰 指示剂卢卡斯固体厌氧指示剂 布鲁氏指示剂,亚甲基兰 指示剂,6葡萄糖水溶液 20.1N氢氧化钠水溶液 0.10.05亚甲基兰水溶液 0.2 厌氧 无色 残存有氧气 蓝色,卢卡斯固体厌氧指示剂,2硼砂溶液 5毫升9硫乙醇酸 1毫升酚红溶液 0.10.2毫升0.02美兰溶液 10毫升琼脂 1 厌氧 无色 残存有氧气 蓝色,布鲁氏指示剂,60羟甲基氨基甲酯 14葡萄糖 10.02美蓝 1 厌氧 无色 残存有氧气 蓝色,Gas-Pak罐的使用操作程序,平皿培养基装入平皿架中置厌氧罐内；打开内盖居中金属网袋，装入触媒钯粒；打开锡箔纸袋，取出厌氧指示剂片；剪开气体发生袋一角，注入10毫升水，迅速紧闭罐盖，置培养箱中培养。约经510分钟后，放入厌氧指示剂片。,2.2.1 简易厌氧罐,干燥器容内径（厘米）容器1 容器2 容器3 容积（毫升）硼氢钠 氯化钴 0.2克 柠檬酸0.6克 15cm（约2150毫升）或 和 0.6克 钯粒1.5克 碳酸氢钠0.7克18cm（约3500毫升）硼氢钠 氯化钴0.33克 柠檬酸1克 或 和 1克 钯粒2克 碳酸氢钠1.15克,2.2.2 厌氧袋法,聚碳酸酯（复合塑料膜）制厌氧袋 产气袋厌氧指示剂触媒,2.2.3 保险粉的厌氧罐培养法,二亚硫酸钠（Na2S2O4）碳酸氢钠 无水硫酸钠 不用触媒,2.3 钢丝绒法,酸性硫酸铜溶液 钢(铁)丝绒 铜和铁的络合物 O2 厌氧指示剂,酸性硫酸铜溶液：将自来水1升加硫酸铜60g，吐温-80 20ml，加热溶解后，又加入2N的硫酸90ml，最后加水至6升；方法：取56g钢丝绒/L，于11.5升酸性硫酸铜溶液浸泡3060s，钢丝绒变成红铜色，挤净液体置铝质或玻璃容器中，放入厌氧罐内。随后将厌氧指示剂放入，密封厌氧罐，14h后可达厌氧状态,2.4 焦性没食子酸法,焦性末食子酸粉末，NaHCO3或NaOH溶液 无菌玻片 已接种细菌的平板倒扣在上面 融化的白蜡封边,2.5 抽气换气厌氧培养法,玻璃干燥罐 混合气钢瓶:10二氧化碳、10的氢气、80的氮气 三通阀触媒:钯粒/浸泡钢丝绒/氯化钴 厌氧指示剂,2.6 生物好氧厌氧培养法,疱肉培养基:牛肉渣 0.5g 牛肉浸液 7ml 液面上加盖34mm厚的融化凡士林，灭菌。生物好氧厌氧培养方法,2.7 转管技术和气体喷射培养法,360钢瓶进气 铜柱 除氧气体（亮黄色）微量O2 H2源 CuO（黑色）接种或移植,2.8厌氧手套箱法,又称厌氧室法,3 厌氧培养方法的选择,亨格特的预还原灭菌厌氧培养基的转管技术、气体喷射培养法 厌氧手套箱培养法 用于要求严格的厌氧培养法的微生态学（正常菌群）的研究工作 厌氧罐(袋)法结合其它厌氧培养方法 不适用于对氧极其敏感的厌氧菌。但是在临床细菌的检验工作中，可以充分使用此法分离感染症中的厌氧病原菌。,4 厌氧菌的保存,4.1继代保存：以GAM半固体流动培养基和TEP半固体培养基作传代培养保存。用毛细吸管吸菌进行继代培养，使用白金接种环移菌接种，可以避免有的菌在操作中接触空气或氧化物而死亡。数周作一次继代培养。新分离的的菌种，在几个月内，每34星期传代一次。被保存的菌种，放室温下暗处。最好是不同菌用不同培养基保存。,4.2 冷冻保存：20脱脂牛奶0.5ml分注在带螺旋塞的玻璃瓶中，经110、15分钟高压灭菌，冷却后，先用毛细吸管取半固体高层培养基2448h生长茂盛部位的厌氧菌液0.5ml，加入玻璃瓶中，直接置于80冰库中保存。厌氧菌较理想的保存方法是液氮保存法。将108以上浓菌液置脱纤维羊血、脱纤维兔血或羊血牛奶各半的分散剂中，先在干冰中预冻，然后连容器一起放入液氮罐中。,谢谢,
