鱼类免疫学概述.ppt
鱼类免疫学概述 冯守明 天津市水产养殖病害防治中心,前 言 鱼类具有与高等脊椎动物相似免疫防御系统调控基因及基因控制产物，具备机体行使免疫功能的组织、细胞及分子基础。鱼体免疫组织除了分布于胸腺、脾脏及头肾等器官中的系统淋巴组织（Systemic lymphoid tissue）外，还包括分布于皮肤、鳃和肠等器官中的黏膜相关淋巴组织,又称为粘膜淋巴组织（mucosa-associated lymphoid tissue,MALT），它们共同构建了鱼体免疫的物质基础）。鱼类的系统淋巴组织一般是由网状细胞作为框架支撑着能迁移或不能迁移的细胞群所构成，具有一定的组织结构，其中的主要细胞群是行使淋巴组织特异性和非特异性免疫防御的主要功能细胞，如：B、T淋巴细胞、巨噬细胞、粒细胞等。与系统淋巴组织相比，鱼类粘膜免疫系统的组织细胞学基础研究还不深入，其组织结构及功能细胞没有被充分认识，特别是鳃及皮肤免疫组织的相关研究则更为薄弱，一定程度上阻碍了鱼类免疫学的发展及免疫技术的应用。,鱼类免疫学的几个重要概念 1.免疫（immune，immunis）：机体免疫系统对抗原物质的一种生物学应答过程。2.免疫应答：是指鱼体淋巴组织中的免疫细胞对内外环境的抗原信号的反应过程，是免疫系统的本质功能，包括特异性免疫应答和非特异性免疫反应。3.特异性免疫应答：特异性免疫应答是指，鱼类系统免组织接受抗原信号后，其中的免疫活性细胞会产生对抗原识别及呈递、细胞的活化、增殖、分化等一系列复杂的生物学反应过程，最终体内产生抗体，发生特异性免疫效应，特异性免疫应答具有特异性、多样性、免疫记忆和自身调节的特点。,4.非特异免疫应答：鱼类免疫系统免疫组织接受内外援信号刺激后，其中先天存在的天然防御机制也会发挥作用，产生非特异性免疫应答，其特点为非特异性、反应强度弱及不具有免疫记忆等(Dalmo et al.,1997)。5.特异性免疫与非特异性免疫应答的关系：与哺乳动物相似，鱼类系统组织的特异性和非特异性免疫应答，是密切相关的一对免疫过程，两者相互协同、彼此加强,两者具有部分相同的功能细胞，例如巨噬细胞，其既可以行使非特异性免疫的吞噬功能，同时其在特异性免疫中又具有抗原吞噬、加工、处理及呈递的功能(Yano,1996；安庆云，1998)。6.系统免疫组织及系统免疫应答：除了分布于胸腺、脾脏及头肾等器官中的免疫组织成为系统淋巴组织（Systemic lymphoid tissue），由其承担的免疫应答反应为系统免疫应答。,7.粘膜免疫组织及粘膜免疫应答：分布于皮肤、鳃和肠等器官中的粘膜相关淋巴组织,又称为粘膜淋巴组织（mucosa-associated lymphoid tissue,MALT），它们共同构建了鱼体免疫的组织细胞学基础（Dalmo et al.,1997;Delamare-Deboutteville et al.,2006;Cain et al.,2000;Rombout et al.,1993）。由其承担的免疫应答反应为粘膜免疫应答。,鱼类免疫学领域中的几个重要科学问题1.鱼类粘膜免疫1.1鱼类粘膜免疫的组织、细胞及分子学基础 皮肤 组织细胞学基础：鱼类皮肤中存在淋巴细胞等白细胞；一些硬骨鱼类的皮肤中存在特异性免疫功能细胞已经被直接或间接证据所证明。虽然不能确定这些细胞是皮肤组织发育的“本土细胞”还是源于其它组织的迁入细胞，但是为鱼类免疫学家提供了遐想的空间和研究的学术节点。因此，鱼类皮肤的特异性免疫的组织细胞学基础研究已经成为了鱼类免疫学研究热点之一。免疫因子：Fletch和Gant通过口服和注射接种方式免疫鲽鱼（Pleuronectes platessa）后，在其皮肤粘液中检测到免疫球蛋白；Lobb等从羊头鲷皮肤粘液中分离出二聚体和四聚体的Ig。鱼类皮肤组织及其分泌粘液中存在着多种非特异性免疫因子，目前得到证实的因子包括：溶菌酶、水解酶、转移因子、C-反应蛋白、几丁质、凝集素、抗菌肽等。,1.1.2 鳃免疫组织与细胞：上皮细胞与支持细胞之间形成窦状隙中，可以观察到中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、巨噬细胞、淋巴细胞等白细胞；Davidson等（1997）对黄盖鲽（Limanda limanda）灌注后的鳃进行活细胞分离，通过ELISPOT方法检测离体活细胞中存在抗体分泌细胞(Antybody Secreting Cell,ASC)，认为黄盖鲽鳃组织中存在一定数量的能够分泌抗体的B细胞。免疫因子：Lumsden等（1995）采用注射和浸泡免疫鳟鱼（Salvelinus fontinalis）后，在免疫鱼的鳃表收集粘液中检测到同血清抗体免疫原性相同的抗体蛋白；王辉等（2007）从牙鲆(Paralichthys olivaceus)鳃组织中提取出能够抑制鳗弧菌和金黄色葡萄球菌生长的抗菌肽；华育平等（2005）认为史氏鲟的鳃组织中存在溶菌酶。,1.1.3 肠免疫组织与细胞：比较解剖学研究结果表明，大量的白细胞群分布于肠道粘膜组织中；Romano等（1997b）及Heidi（2005）对鲤鱼、Santos等（1997）、Scapigliati(1999)对鲈鱼的肠单细胞悬液中的白细胞进行单抗间接荧光标记及流式细胞计数后发现，鱼肠组织中存在一定数量B、T细胞。免疫因子：诸多学者已经证明鱼类肠道内分泌粘液（Jones et al.,1999;Hart et al.,1988;Joosten et al.,1997;Esteve-Gassent et al.,2004）及胆汁（Rombout et al.,1986;Lobb et al.,1981b;Jenkins et al.,1994;Vervarcke et al.,2005）中存在抗体蛋白；Mulder等（2007）认为，在虹鳟鱼肠粘膜组织中存在能够合成干扰素IL-1b，IL-8,TNF-和IFN-的功能细胞；另外，一些学者还在肠组织检测到一些非特异免疫因子，如补体（Lange et al.,2004）、蛋白酶及溶菌酶等（Magnadttir et al.,2005；华育平等，2005）。,1.2 粘膜免疫应答 与鱼类系统免疫应答相似，鱼类粘膜免疫应答也包括特异性免疫应答和非特异性免疫两种方式，两者相互协同、彼此加强,共同行使鱼类粘膜免疫系统的免疫防御功能。与鱼类系统组织的非特异免疫功能相比，粘膜组织的非特异免疫作用更为重要。,鱼类粘膜组织的非特异性免疫 第一，皮肤、鳃及肠粘膜组织粘液的分泌及其对侵袭原的粘附应答：鱼类的皮肤、鳃是与环境接触最密切的器官，肠粘膜组织与肠腔环境接触也很密切，因此在其表层的表皮粘膜组织层可以作为生理屏障护被着鱼体，直接阻止外源性生物及有害物质的侵入。在外界环境因子改变后或在刺激原刺激下，粘膜组织中的粘液细胞可以对环境刺激产生粘液分泌应答，达到保护鱼体免受伤害的作用。研究表明，粘膜组织分泌粘液的量值与环境因子的刺激强度有着直接的关系，同时，粘液的粘附能力与刺激原的种类有关系，例如，鱼类的体表粘液和肠道粘液对不同种类细菌的粘附能力具有明显差异性，该研究结果可以作为鱼病防治以及肠道有益菌的筛选的依据。,第二，细胞吞噬应答：一些学者在研究粘膜免疫组织对抗原的摄取时发现，皮肤的上皮细胞对颗粒或大分子具有吞噬能力，鳃及后肠中的巨噬细胞、单核细胞及粒细胞也能吞噬颗粒或大分子，在一定物质刺激下或环境条件改变后，这些细胞的吞噬活性会发生相应的变化。Clerton等认为，在大剂量维生素 E的刺激下，虹鳟肠道粘膜组织中的白细胞的吞噬活性明显增强，并推断这可能与维生素 E 能增强吞噬细胞膜的流动性有关。另外，Flano 等（1996）发现虹鳟鱼体外培养的鳃组织在受到细菌刺激后，嗜曙红粒细胞(eosinophilic granule cells,EGCs)数量明显增加。Woo认为EGCs能在鱼类鳃和肠等粘膜部位参与宿主对蠕虫的非特异性免疫应答。,第三，粘膜组织及其分泌粘液中非特异性因子的应答：研究表明，鱼类粘膜组织及其分泌粘液中的溶菌酶、干扰素等非特异性因子对侵袭原能够产生非特异性免疫应答。Mulder等采用细菌(Aeromonas salmonicida)悬液浸泡感染虹鳟鱼后发现，鱼肠粘膜组织中合成IL-1b，IL-8,TNF-和IFN-等干扰素的功能细胞数量明显增加。Lindenst等则认为寄生虫的感染强度与虹鳟鱼皮肤粘膜组织中的干扰素IL-1的表达存在着密切的关系，推断寄生虫感染可以诱导皮肤粘膜组织产生独立的非特异性免疫应答。华育平等研究表明，史氏鲟感染嗜水气单胞菌后，消化道和鳃组织中及体表粘液中的溶菌酶含量发生明显变化，并且组织和粘液中溶菌酶含量与环境温度存在着密切的关系。,1.2.2 鱼类粘膜组织的特异性免疫应答 关于哺乳动物粘膜系统特异性免疫应答的研究已经比较清楚了，当抗原接触粘膜组织后,可以引起局部的独立免疫应答,并分泌特异性的 IgA 抗体进入体液及粘液中，产生免疫效果。鱼类粘膜免疫系统是否能够独立完成特异性免疫应答，曾经一度引起了相当大的争议。近年来，随着研究的深入，越来越多的学者认为，鱼类粘膜免疫系统可以不依赖系统免疫，独立完成抗原分子的识别、呈递及抗体分泌，进而独立完成局部抵御病原入侵的特异性免疫应答。但是，由于鱼类粘膜免疫应答研究起步较晚，因此该领域还存在着诸多薄弱点。第一，皮肤、鳃和肠三种粘膜组织特异性免疫的研究水平不同，一些粘膜组织（如皮肤）研究水平比较低。第二，粘膜组织特异性免疫应答研究不系统，对B细胞的免疫应答及Ig的分泌动力学研究较多，对抗原的识别和呈递则不足。第三，对不同种类鱼的粘膜特异性免疫应答研究水平存在差异。,皮肤的特异性免疫应答 一些学者研究结果为皮肤粘膜组织具有特异性免疫应答功能提供了间接依据。最有力的证据来自Xu等人的工作，他们对经小瓜虫（Ichthyophthirius multifiliis）感染后的河鲶皮肤（已经去除虫体）进行离体培养后发现，在培养液中可以检测到针对小瓜虫的特异性抗体蛋白，分子量与血清中的免疫球蛋白一致，认为皮肤在抗原刺激后可以独立产生特异性免疫应答。另外，Esteve-Gassent等对经过免疫后的欧洲鳗、Cain等对虹鳟及Rambout等对鲤鱼的研究结果表明，免疫鱼的体表粘液中抗体蛋白呈现出与血清抗体蛋白不同的免疫应答动力学规律。上述研究结果一定程度上证明了鱼类皮肤粘膜组织可以独立完成特异性免疫应答。,1.2.2.2 鳃的特异性免疫应答 目前对于鱼类鳃粘膜组织的特异性免疫应答的研究比较系统，研究内容涉及抗原的识别和呈递、抗体分泌细胞对特定抗原的应答以及鳃表粘液抗体应答动力学等内容。（1）鳃的抗原的识别和呈递：抗原的识别及呈递是特异性免疫应答的关键环节，特别是由T细胞参与的情况下更为重要。抗原的识别和呈递主要是由巨噬细胞完成的，鳃组织中的巨噬细胞识别并吞噬进入体内的抗原，然后对抗原进行加工呈递。Morrison等用Neoparamoeba sp.悬液人工浸泡感染大西洋鲑后，采用免疫组化原位标记的方法，在被感染鱼的鳃粘膜组织中检测到主要组织相容复合体类分子阳性细胞，并且阳性细胞中组织相容复合体类分子的表达量呈现一定动态规律，进而推断鱼类的鳃粘膜组织中MHC的表达是在高度调控下完成的，这类似于哺乳动物粘膜组织的抗原呈递方式。,（2）鳃粘膜组织中免疫蛋白分泌细胞对特定抗原的应答：Santos等采用一种全菌（Photobacterium damselae spp.）疫苗浸泡免疫石齿鲈(Dicentrarchus labrax)幼鱼，然后检测不同时间点上免疫鱼鳃组织中的抗体分泌细胞（Antibody Secreting Cell,ASC）的数量，发现免疫鱼鳃组织中ASC 数量呈现出明显的应答动力学规律。Davidson等（1997）用人免疫球蛋白注射免疫黄盖鲽（Limanda limanda）后，检测灌注鳃组织及外周血中ASC 数量，结果表明鳃组织中ASC 数量呈现出与外周血不同的应答动力学规律。,（3）鳃表粘液抗体应答动力学：作为鳃粘膜组织存在特异性免疫应答的间接依据，鱼类鳃表粘液特异性抗体的免疫应答规律已经被一些学者发现。至今在免疫后的非洲鲶鱼（Clarias gariepinus）、虹鳟（Oncorhynchus mykiss）及石齿鲈(Dicentrarchus labrax)等鳃表粘液中存在针对免疫原的特异性抗体应答动力学规律，并且与血清抗体应答动力学呈显著差异。,肠粘膜免疫组织的特异性免疫应答（1）抗原的识别和呈递：鱼类肠组织中存在类似于哺乳动物的M细胞的巨噬细胞，主要分布在后肠组织中，具有抗原的识别、摄入和加工的功能。肠道中颗粒状或大分子抗原首先由上皮层包裹，然后传递到巨噬细胞所在的组织层，巨噬细胞识别并吞噬抗原，然后对抗原进行加工呈递。与鳃相似，肠粘膜组织的抗原处理及呈递的具体机制还不甚清楚，相关的研究报道很少。Koppang等用灭活全菌疫苗腹腔注射免疫大西洋鲑后，通过RT-PCR的方法检测免疫鱼后肠组织中MHC链表达水平发现，免疫鱼的后肠组织中MHC的基因表达高于对照鱼，但是差异不显著。因此，根据现有研究结果只能推断肠粘膜组织中存在抗原处理及呈递过程。,（2）肠粘膜组织中免疫蛋白分泌细胞对抗原的应答：Bermdez等采用人工感染的的方法使大菱鲆感染粘孢子虫（Enteromyxum scophthalmi）并表现典型的粘孢子虫病症状，然后原位检测病鱼和对照鱼肠组织中的Ig+细胞的数量变化，发现患病鱼的肠固有层中的Ig+细胞数量显著高于对照鱼，并且随着虫体感染强度的增加，Ig+细胞数量呈明显的增加趋势，认为鱼类的肠粘膜组织中的 Ig+细胞对体内寄生虫存在明显的免疫应答。然而，一些学者用全菌疫苗浸泡免疫石齿鲈后，肠组织中抗体分泌细胞则没有出现明显的免疫应答，这可能与浸泡接种抗原对鱼体肠组织的刺激弱有关系。,（3）肠表粘液及胆汁抗体应答动力学：研究表明，在注射和肛门灌注免疫后的非洲鲶鱼和鲤鱼的胆汁中、口服和肛门灌注免疫后的鳗鱼的肠表粘液中以及注射和口服免疫后的虹鳟的肠表粘膜粘液中都呈现出与血清不同的抗体免疫应答动力学规律。因此，多数学者认为，通过抗原对肠组织进行有效刺激（肠道感染病原、口服或肛门灌注疫苗），鱼类肠表粘液和胆汁中可以产生Ig特异性免疫应答。,皮肤、鳃和肠粘膜免疫组织特异性免疫应答 的相互关系：一些学者在研究非洲鲶鱼粘膜组织对注射、浸泡、口服及肛门灌注全菌疫苗的免疫应答时发现，后肠粘膜组织对抗原的识别、摄入可以对远离肠组织的鳃和皮肤粘膜组织产生有效的抗原刺激，进而诱导鳃和皮肤产生粘膜特异性免疫应答，因此，他们认为在非洲鲶鱼的体内存在着一个公共粘膜免疫系统（common mucosal immune system），不同的粘膜组织免疫应答之间存在着某种联系，而这种联系不是通过系统免疫介导的。,1.3鱼类粘膜特异性免疫与系统特异性免疫的关系 两系统间免疫细胞的比较 鱼类粘膜免疫组织中存在种类齐全的免疫功能细胞，细胞种类及功能与系统免疫系统相似，然而，鱼类系统免疫与粘膜免疫系统在发育及进化中的关系和先后顺序尚未确定，因此，无法确定粘膜系统中的免疫细胞是由粘膜组织自身细胞分化而来还是由系统免疫组织的迁入。鱼类组织胚胎学研究结果表明，鱼类胸腺是由第二鳃囊发育而成，一定程度上可以推断鳃粘膜组织可能先于胸腺组织进化，而鳃粘膜组织中免疫细胞可能是由自身组织细胞分化而来。一些研究结果则暗示粘膜系统中的免疫细胞是源于其它组织细胞的迁入，研究者认为在某些诱导白细胞迁移的化学因子作用下，其它组织中（包括血液）的白细胞易迁入粘膜组织中，而不易从粘膜组织迁出，进而成为粘膜组织的组成细胞。,两系统间免疫因子的比较 关于鱼类粘液Ig与血清Ig是否为同一抗体蛋白目前仍存在一定的争议，多数研究表明，鱼类粘液中抗体的免疫原性、结构及理化性质与血液抗体具有很强的相似性，两者为同一种抗体蛋白。Lobb 等（1987）将斑点叉尾鮰浸泡在含有DNP标记的马血清蛋白溶液，以刺激斑点叉尾鮰产生特异性抗DNP标记抗白蛋白的抗体，结果发现从皮肤粘液中分离纯化的抗体和血清中的抗体在半体共价结合方式和轻链或重链方面，都没有明显的区别。另外一些研究表明，一些鱼类的粘液抗体蛋白与血清中的抗体蛋白在结构、理化性质及免疫原性等方面，都存在着明显的差异，两者不是同一种抗体蛋白。,两系统间特异性免疫应答的关系 一些学者认为，鱼类的粘膜免疫系统不能完成或至少不能够独立完成特异性免疫应答，依据为：首先，腹腔注射免疫后,一些种类鱼体的粘液抗体虽然显著增加，但其变化动力学规律与血清抗体一致，表明粘液抗体主要来源于系统免疫应答（Cain et al.，2000；LaFrentz et al.，2002）；其次，浸泡免疫后，体表粘液中针对疫苗的抗体水平没有明显增加趋势，暗示粘膜组织没有产生特异性免疫应答(Grabowski et al.，2004；Santos et al.，2005)。但是，浸泡免疫后体表粘液中抗体含量不增加，有可能与两系统产生抗体种类差异及检测方法有关；注射免疫后血清抗体也有可能伴随分泌物转移到表粘液，进而对粘液中抗体动力学产生影响。因此，这些研究结果都不足以作为否定粘膜系统独立能够完成特异性免疫应答的依据。,诸多者认为，粘膜免疫系统可以不依赖系统免疫系统，独立完成特异性免疫应答：首先，浸泡免疫后，鳃、皮肤和肠粘膜组织首先产生较强烈的免疫应答，主要体现在粘膜组织表面粘液或胆汁中抗体水平的显著增加以及组织中抗体分泌细胞数量显著增加，而系统免疫应答较弱甚至检测不到，并且应答时间比粘膜组织晚（Esteve-Gassent et al.，2004）；其次，注射免疫后，系统免疫首先产生很强免疫应答，而鳃、皮肤和肠粘膜组织则较弱甚至检测不到（Vervarcke et al.，2005；Santos et al.，2000）；第三，口服或后肠灌注免疫后，肠粘膜组织中的抗体分泌细胞数量以及肠粘液和胆汁抗体水平显著增加，肠道粘膜的抗体水平出现高峰的时间早于血清（Cain et al.，2000；Vervarcke et al.，2005）。,2.鱼类免疫接种方法 鱼类免疫接种方法主要包括注射、浸泡、口服及后肠灌注。与哺乳动物相比，鱼类免疫接种方法比较复杂，不同免疫接种方法所需的操作条件、可操作性以及对免疫对象产生的副作用各不相同，同时，不同免疫接种方法的免疫效果差异很大，因此，实际操作中，要根据免疫对象种类和数量以及免疫目的来选择适当的免疫接种方法。,2.1注射免疫 鱼类注射免疫接种是从哺乳动物借鉴过来的经典方法，包括肌肉注射和腹腔注射两种方式。注射免疫主要诱导鱼体系统免疫应答，可以使血清抗体极显著增加，免疫保护率高于其它免疫接种方法，免疫效果明显且稳定；并且疫苗剂量准确、可控，环境条件对疫苗影响小，因此，适合于免疫学研究的小样本试验免疫及小规模集约化养殖鱼类的生产免疫。但是该方法费时费力，对受体鱼造成机械损伤及很强的应激性刺激,对鱼苗和较小的鱼类不适用，也不适合于大规模养殖鱼类的生产免疫。,2.2 浸泡免疫 浸泡免疫接种是鱼类等水生动物所特有的一种免疫接种方法，是指将免疫对象放到含有一定浓度疫苗的溶液中浸泡一定时间，以达到对鱼体进行免疫的目的。另外，喷淋免疫作为浸泡免疫的一种变化形式，是指用一定浓度的疫苗溶液喷淋鱼体以达到免疫目的。浸泡免疫既可以诱导鱼类粘膜免疫也可以诱导系统免疫，其理论基础是鱼类皮肤、鳃粘膜组织具有抗原摄入及特异性免疫应答等免疫学功能，通过皮肤、鳃摄入体内的抗原又可以扩散到外周血、头肾和脾脏等系统免疫组织进而产生系统免疫应答。浸泡免疫的优点主要在于对鱼体造成机械损伤及应激性刺激都较小、便于群体免疫、劳动强度小、耗时短等；浸泡免疫的缺点为对鱼体的免疫保护率低于注射免疫且不稳定，浸泡环境条件对疫苗效果影响大，以及浸泡免疫需要的疫苗量较大，对于制备方法复杂、成本高的疫苗不适用，如：亚单位疫苗、DNA疫苗等。,2.3 经口及后肠灌注免疫 经口免疫是指采用投喂或口灌的方法将疫苗送入鱼体消化道，以达到对鱼体免疫的目的；后肠灌注又叫肛门灌注，是指将疫苗通过肛门直接灌注到鱼体后肠的疫苗接种方式。如前所述，经口免疫和肛门灌注都是由消化道粘膜组织摄入抗原，可以同时诱导粘膜和系统特异性免疫应答，是免疫应答机理比较的清除的免疫途径。经口免疫优点主要表现为，对鱼体造成机械损伤及应激性刺激较小、便于群体免疫、劳动强度小等优点；同时，由于是体内接种，还克服了浸泡免疫的需要疫苗量大及环境条件对疫苗的影响，因此，实际应用也比较广泛。然而，鱼类消化道的抗原摄入功能区主要为后肠，胃和前肠对抗原的摄入能力很低，并且含有多种酶类和酸性物质，研究表明，消化道中的酶类和酸性物质对疫苗免疫原性具有一定的破坏作用，将疫苗直接添加到饵料中或粘附于饵料表面对鱼体进行口服免疫，免疫效果不稳定。因此，如果欲将高效疫苗的送达后肠，就必须采用适合的材料（如：饵料原料物质和脂质体等）对疫苗进行复杂包被处理，使疫苗在后肠释放，同时又要制备成适合鱼口味的口服疫苗，这已经成为口服免疫接种技术应用的关键技术，也是制约因素之一。,3.主要鱼用疫苗 Duff（1942）应用福尔马林灭活的杀鲑气单胞菌(Aeromonas salmonicida)免疫硬头鳟，使免疫鱼获得了抗疥疮病的免疫力，为最早的有关鱼类疫苗的研究报道。此后，随着鱼类养殖业的不断发展，特别是工业化集约养鱼模式的兴起，推动了鱼用疫苗的研究进展，提供了疫苗应用空间。至今，鱼用疫苗的种类几乎涵盖了人用疫苗的所有种类，在国外一些传统型疫苗已被批准上市，成为鱼用商品疫苗,并取得了较好的应用效果，例如灭活的单一及联合全菌疫苗、灭活病毒疫苗等；一些种类疫苗则处于实验室小试或临床应用阶段，也具有较好的免疫效果，但不甚稳定，如DNA疫苗、亚单位疫苗、合成肽疫苗等。,
