质粒DNA提取鉴定.ppt
质粒DNA提取、鉴定,暨大医学院生化教研室蒋建伟,质粒是真核细胞细胞核外或原核生物拟核区外能够进行自主复制的遗传单位。现在习惯上用来专指细菌(大肠杆菌）、酵母菌和放线菌等生物中细胞核或拟核中的DNA以外的DNA分子（补充：部分质粒为RNA）。在基因工程中质粒常被用做基因的载体(Vector)。有些质粒称为附加体(episome)，这类质粒能够整合进真菌的染色体，也能从整合位置上切离下来成为游离于染色体外的DNA分子。,质粒（plasmid）：存在于细菌染色体外的小型环状双链DNA分子，可在宿主细胞中自主复制，并在细胞分裂时传给子代。质粒感染细菌后，会赋予宿主细胞一些遗传性状（如对青霉素或重金属的抗性)可作为筛选转化子细菌的根据。,质粒分类：严紧型（每个细胞15个质粒），当细胞染色体复制一次时，质粒也复制一次；松弛型（每个细胞10200个质粒）。如果用一定的药物处理还会使质粒拷贝数增至几千份。一般分子量较大的质粒属严紧型。分子量较小的质粒属松弛型。质粒的复制有时和它们的宿主细胞有关，某些质粒在大肠杆菌内的复制属严紧型，而在变形杆菌内则属松弛型。,pBR322质粒(4363bp):主要包括：限制性内切酶位点（插入外源基因）；含有terr、ampr抗药基因，可作为筛选标志。含有复制起始点ori（赋予其复制特性）。,四环素抗性基因（Tetr）失活,(插入失活法)抗药性标记选择,M13噬菌体：M13mp系列 pUC系列 pUC质粒:含E.coli的LacZ的N端146个AA残基的编码基因，编码产物为半乳糖苷酶的片段。LacE.coli（突变型宿主细胞）：可表达该酶的片段.单独存在的或片段均无活性，只有宿主细胞与克隆载体同时共表达两片段，宿主细胞才有半乳糖苷酶活性，使特异底物产生蓝色化合物（-互补)。,互补的检测,片段,片段,片段,本实验：大肠杆菌pEC-ct质粒，pEC-ct质粒：8.0kb(6.8kb)有Hind,BamH 酶切点，可切出CD基因（1.2kb）,本实验包括：1.细菌培养和质粒扩增2.菌体收集3.菌体裂解、质粒DNA提取、纯化4.鉴定,2人一组,操作,细菌的培养 接种：从-20取出菌种，斜面划线接种，37 培养24 h单克隆培养：挑单个菌落，接种于LB培养液中（含Amp 50g/ml)4-6 h。菌液0.2 ml10 ml LB培养基（含Amp 50g/ml)37 培养过夜。,周四：00 每小组来一个代表，在林春兰老师指导下完成。,4.扩大培养：培养液3 ml,接种于60 mL 的LB培养液（含Amp 50g/ml),振摇200 rpm，37(4-6 h),使A580。5.加氯霉素：加氯霉素，终浓度40 g/ml，继续培养15-17h.,周五P.M.由林春兰老师完成。,周五A.M.10:00 每小组来一个代表，在林春兰老师指导下完成。,周六8:00.去医学院7楼，2人/份,1.取6 个1.5 ml Eppendorf 管，分别加细菌培养液1.4 ml 9000rpm 2-3min 弃上清2.600 l STE液依次溶解各管沉淀，合并一管 再用200 l STE液清洗各管，清洗液合并上管（收集菌体）9000rpm 2-3min,弃上清（保留菌体）,收集菌体,3。沉淀悬于200 ul溶液I，混匀 放置 5 min 4。加入400 ul溶液II，颠倒混匀数十次（2030次）0.2N NaOH-1%SDS 放置5 min 5。加入300 ul溶液III，充分混匀（温和操作）10 min,沉淀DNA,KAc-HAc,裂解,碱裂解法提取质粒DNA,RNase,12000rpm 3min 弃沉淀 6。将上清转移至另一Eppendorf管中，加0.6倍体积异丙醇(540 ul)，倒转混匀 室温5 min 离心12000rpm 10 min 弃上清 沉淀干燥，室温 5 min 7。加TE 500ul溶解沉淀,同时倒胶1%,330ml/小班,沉淀质粒,去除基因组DNA和蛋白,8。加入等体积饱和酚，振摇1min，充分混匀 12000rpm 5min9。将上层水相转移至另一Eppendorf管中，用等体积氯仿-异戊醇抽提，振摇1min，充分混匀 12000rpm 5min10。将上层水相转移至另一Eppendorf管中，加入预冷的2.5倍体积无水乙醇-20 30 min,Lunch time,纯化质粒,易错,离心 12000rpm 10 min 弃上清 沉淀干燥 11。加入TE 30-50-100 ul,溶解沉淀（反复吹打至 完全溶解）,EP管上做记号,质粒的分离、纯化,半定量检测浓度,酶切,电泳鉴定,鉴定质粒线性化质粒，电泳后与marker比较，估计质粒大小。线性化：用Hind将质粒酶切、电泳，估计其分子大小。双酶切：用Hind和BamH 将质粒pEC-CT所含的CD基因1.2kb片段切出。,鉴定(质粒分子量、纯度及是否含有所需要DNA段)(一)酶解双酶切体系：单酶切体系：sample 5 ul sample 5ulBamH 1 ul Hind 1 ulHind 1 ul 10buffer 2.5 ul 10buffer 2.5 ul ddH2O 15.5 ul ddH2O 16.5 ul 混匀，离心(瞬时)，371,13。DNA浓度测定 溴乙锭荧光法(半定量法，一大组/板),（1）制备1%琼脂糖凝胶板（塑料平皿中）凝固后待用。（2）点样：标准溶液（Marker：老师加）1.0 0.5 0.25 0.1 0.05 0.025 0.01 ug/ul 分别吸取1ul点于制好的琼脂糖平板上 样品 吸取1ul，滴加于琼脂板上。(3)浓度测定：避光，小时后，在紫外灯下观察各点荧光强弱，从而 估计样品DNA浓度。,14。电泳,1.制胶2.点样（1）质粒提取液 5 ul+TE 15 ul（2）单酶切液 25 ul（3）双酶切液 25 ul 各加上样液溴酚兰 5 ul（4）Marker 老师加 4小组3道12 道 Marker 1道,画示意图,3.电泳 电压：120V 2min 100V 0.5-1.0 h 待溴酚蓝走至6-7cm左右，终止电泳。观察结果：紫外灯下，照相。,marker DL 15000:15000,10000,7500,5000,2500,1000,250bp上样液：50甘油、0.25M EDTA,0.05%溴酚蓝，pH8.0,质粒,单酶切,双酶切,质粒一般分为3条带。现质粒较大，只见开环状，未见线性、超螺旋质粒。如RNA未除净，前方会有片状荧光，孔内荧光为细菌基因组DNA,实验报告2周后交交给各小班班长（3个小班），交周老师实验报告：原理 实验方法（流程图）结果、结论 讨论 A4纸，手写。（写明带教老师，同组同学）,
