聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳分离血清蛋白.ppt

聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳分离血清蛋白【实验目的】1.学习聚丙烯酰胺凝胶电泳原理 2.掌握聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳的操作技术【实验原理】聚丙烯酰胺是由单体丙烯酰胺（简称Acr）和交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺（简称Bis）在催化剂过硫酸铵（简称AP）和加速剂N,N,NN-四甲基乙二胺(简称TEMED)的作用下,聚合交联而成的三维网状结构的凝胶。,聚丙烯酰胺凝胶电泳分离原理分子筛效应：分子量或分子大小和形状不同的蛋白质通过一定孔径分离胶时，受阻滞的程度不同而表现出不同的迁移率，这就是分子筛效应。电荷效应：电荷量不同，迁移率不同。浓缩效应,【实验器材】样品：血清凝胶储备液：1号液：pH8.9 TrisHCl缓冲液+TEMED2号液：Acr+Bis3号液：AP电泳缓冲液：pH8.3 的Tris-Gly 缓冲液染色液：氨基黑溶液 脱色剂：冰乙酸,【实验器材】电泳仪、圆盘电泳槽、电泳玻璃管、青霉素小瓶盖、微量注射器、长针头注射器、烧杯、移液管、ParaFilm膜。,【实验步骤】1.凝胶的制备（1）准备工作：用ParaFilm膜密封细橡皮塞的一端，塞入放到木质试管架上的小瓶塞中；,（2）制备小孔胶（分离胶）凝胶浓度:7.5%,2.灌胶，装胶用滴管吸取凝胶沿管壁装入玻璃管中，检查管内无气泡，加完凝胶后沿管壁缓缓注入几滴蒸馏水，聚合约40-60分钟；时间到后，轻轻取下管底部的橡皮塞和ParaFilm膜，用滤纸吸取凝胶上方水层，将凝胶管垂直插入电泳槽圆孔中并尽量使各管高度一致，其余孔用胶塞堵住，电泳槽内加注电泳液；,3.加样：用微量注射器吸取20/50ml 的样品（含溴酚蓝），沿内壁缓慢加入，注意观察样品的状态变化；4.电泳：负极在上，正极在下，电流调节到2mA/管，开通电源；2min后，电流调节到5mA/管，电泳约1h左右，直到溴酚蓝跑到凝胶底部。,5.剥胶,6.固定与染色：将取下的胶条放入染色液中，在室温下，固定染色10min。7.脱色：将染色完毕的胶条用自来水冲洗后浸泡在脱色液中；8.观察并图示记录实验结果。,