突变和多态的分析.ppt
常用的基因突变和多态分析技术,各种检测突变方法的相对灵明度,基因突变与检测方法的选用,基因异常 方 法 探针、引物或限制酶基因缺失 Southern杂交 缺失基因的探针 PCR分析 引物包括缺失或在缺失部位内点突变 RFLP分析 突变导致其切点消失的限制酶 ASO杂交 正常和异常的ASO探针 PCR分析 引物包括突变部位（RFLP,SSCP)基因已知但异常不明 基因内或旁侧序列 基因内或旁侧序列探针或引物 多态性（RFLP,AMP-FLP)连锁分析基因未知 与疾病连锁的多态性，与疾病连锁的多态位点探 如AMP-FLP连锁分析 针或引物 RFLP位点单体型连锁分析,等位基因特异的寡核苷酸探针诊断,当基因的突变部位和性质已完全明了时，可以合成标记32P的等位基因特异的寡核苷酸探针（allele-specific oligonucleotide,ASO）来进行诊断。探针通常为20个碱基左右的核苷酸包括了突变位点在内。用于探测点突变时一般需要合成两种探针，一种与正常基因序列完全一致，能与之稳定地杂交，但不能与正常基因序列杂交；另一种与突变基因序列一致，能与突变基因序列稳定杂交，但不能与正常基因序列稳定杂交。这样，使当地调整杂交条件，使只有探针与待测DNA完全一致时才能稳定地杂交结合。就可以把只有一个碱基发生了突变的基因区别开来。,Add radio-labeled normal DNA probes,Amplify DNA and hybridize to membranes,Allele Specific Oligonucleotide(ASO)Hybridization,Add known mutant DNA probes,Patients,#1,#2,#3,#1,#2,#3,10kb,4kb,BamH,BamH,5,3,5,3(),5,3(-),/-/-/-/-,14kb,10kb,地贫基因缺失的诊断 左图示16染色体上携带有数目不同的基因，箭头示BamHI的切点；由图为用基因探针杂交的结果。,缺失的检测,外显子 bp N P,Pm 535,3 410 43 357,50 271 13 238,6 202 47 181,60 139 52 113,DMD基因缺失的多重PCR诊断。共采用9对引物，可见患者(P)有电泳带的缺失。Pm为启动子,荧光原位杂交（FISH）,基因组探针的分离,利用原位杂交的方法进行基因定位,IVS-,IVS-,Mst部位 1.15kb,1.15kb,1.35kb,正常1.15kb,镰变1.35kb,正常 镰状性状 镰状贫血,1.15kb,1.35kb,镰状贫血的基因诊断,Linkage Analysis,Looks for pattern of DNA markers near gene of interest that segregate with diseaseRequires DNA analysis of multiple family members,1,2,3,4,1,3,1,4,2,3,2,4,1234,1,2,1,2,3,4,5,kb,5.7,3.4,2.3,成人型多囊肾病的连锁分析,单链构象多态性诊断法,单链构象多态性（single strand conformation polymorphism,SSCP）是指单链DNA由于碱基序列的不同可引起构象差异。这种差异将是相同或相近长度的单链DNA电泳迁移率不同，从而可用于靶序列DNA中单个碱基的替代、微小的缺失或插入的检测。用SSCP法检测基因的点突变时，通常在疑有突变的DNA片段附近设计一对引物进行PCR扩增，然后将扩增产物用甲酰胺等变性，并在非变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳。突变所引起的DNA构象差异将表现为电泳带位置的差异，从而可据之作出诊断。PCR-SSCP法具有能快速、灵敏地检测有无突变或多态性的优点，但如与阐明突变的碱基性质，则需作进一步的序列分析。,Single Strand Conformational Polymorphism(SSCP),DNA,Gel,Normal,Mutated,mutation,DNA is denatured into single strandsSingle strands fold;shape is altered by mutationsMobility of mutant and normal strands differ in gel,Protein Truncation Assay（蛋白质截短检测）,DNA transcribed to mRNARNA translated to proteinProtein run on gelTruncated protein has different mobility in gel,DNA,mRNA,Protein,Gel,Normal,Mutated,mutation,
