碳水化合物的分析检验.ppt

,碳水化合物的测定,一、概述 二、糖类的提取与澄清三、食品中还原糖的测定 四、蔗糖和总糖的测定五、淀粉的测定六、纤维素的测定 七、糖化力的检验,碳水化合物是生物界三大物质之一，是自然界分布广泛、数量最多的有机化合物，是食品的主要组成分之一。19世纪，化学家测定碳水化合物的组成，发现碳水化合物中含有一定比率的碳、氢、氧元素，并且符合Cm（H2O）n的结构，因此认为是碳和水化合而成，故取名为碳水化合物。进一步研究发现，有些符合这个结构式的化合物不是碳水化合物，如甲醛（CH2O）,乙酸（C2H4O2），乳酸（C3H6O3），而有些碳水化合物却不符合这一结构式如脱氧核糖（C5H10O4），鼠李糖（C6H12O5），有些碳水化合物还含有氮、硫、磷等成分。显然碳水化合物这一名称并不确切，但由于沿用已久，约定俗成，就这样留用下来了。,【引入新课】,（一）碳水化合物的定义 碳水化合物又称糖类或醣，它是多羟基醛、多羟基酮以及它们的缩合物。确切地说，碳水化合物属于含有羰基及羟基的复合功能团化合物类。从结构来看碳水化合物的定义：多羰基醛或多羟基酮以及水解后能够产生多羟基醛或多羟基酮的一类有机化合物。（二）碳水化合物分类碳水化合物的分类方式很多，通常按结构性质分为：单糖、低聚糖和多糖：还原糖、非还原糖；可溶性糖、不溶性糖、转化糖等。,一、概述,单糖 是指用水解方法不能将其分解的碳水化合物，如葡萄糖、果糖、半乳糖，它们都是含有六个碳原子的多羟基醛或多羟基酮；为结晶性固体，极易溶解于水，微溶于乙醇，不溶于乙醚。水溶液具有甜味，并有旋光性，所有单糖都具有还原性，容易被一些氧化剂氧化，如FOLIN试剂等。双糖 由两分子单糖缩合而成，如蔗糖、乳糖、麦芽糖和海藻糖等。双糖的许多理化性质类似于单糖，但只有部分双糖具有还原性，如乳糖和麦芽糖等。蔗糖经水解后生成两分子单糖，具有还原性，水解过程中，旋光度由右变为左，这种旋光性质的变化称为转化，故蔗糖水解后得到的葡萄糖和果糖的混合物称为转化糖。,1、按结构性质分类,（二）碳水化合物分类（2）1、按结构性质分类,低聚糖 是指39个的单糖聚合物，主要有异麦芽低聚糖（多种异麦芽低聚糖的混合物）和棉籽糖、水苏糖、低聚果糖等。所有单糖和双糖都溶于水，又称溶解性糖。多糖：是由10个以上的单糖分子缩合而成的大分子化合物，如淀粉、糊精、果胶、纤维素等。人体可以消化利用的多糖主要是淀粉（包括糊精）。淀粉不溶于冷水、醇、醚等有机溶剂，不具有甜味，无还原性，但在酸或淀粉酶的作用下，可以分步水解，最后能得到具有还原性的葡萄糖。,2、还原糖和非还原糖,还原糖是指具有还原性的糖类，在糖类中葡萄糖分子中含有游离醛基；果糖分子中含有游离酮基；乳糖和麦芽糖分子中含有半缩醛羟基；因而都具有还原性，这些糖类统称为还原糖。不具有还原性的糖类，称非还原糖。非还原糖蔗糖、低聚糖以及多糖（如糊精、淀粉），其本身不具还原性，但可以通过水解而生成相应的还原性单糖，通过测定水解液的还原糖含量就可以求得试样中相应糖类的含量，因此，还原糖是一般糖类定量的基础。,现代营养工作者分为两大类：有效碳水化合物：对人体有营养（提供能量）性的称做有效碳水化合物无效碳水化合物（膳食纤维）：膳食纤维：指人们的消化系统或者消化系统中的酶不能消化、分解、吸收的物质，但是消化系统中的微生物能分解利用其中一部分。对于膳食纤维近几年来人们研究得多。因为它直接关系到人体健康。比如，西方国家的人普遍比东方国家吃得细、精，也就是他们吃的纤维少，谷类食物较少，而动物性食品多，蛋白质、油脂等高，所以在他们国家得直肠癌的人较多。目前引起了他们的重视。最近他们有好多食品厂在面包中加一些膳食纤维（米糠、麸皮等），还专门有些食品直接破碎，比如用小麦、玉米破碎后加工即可食。这样各种维生素没有破坏，对身体有好处。另外还要考虑到粮谷碾磨加工精度时，即要达到一定精白度，还要注意尽量减少维生素的损失。并注意保持膳食中纤维素有一定数量。,3、根据营养分类,1、糖是新生婴儿重要的营养成分。婴儿消化道内含有较多的乳糖酶，这种乳糖酶能把乳糖分解成葡萄糖和半乳糖。而半乳糖是构成婴儿脑神经的重要物质。如果用蔗糖代替乳糖，婴儿大脑发育受到影响。因此我国对婴儿专用乳粉中的乳糖有特别的要求：婴儿配方乳粉,(GB 10766-1997):乳糖占碳水化合物量配方，%90乳糖对于成年人来说，由于体内乳糖酶减少。乳糖不易被吸收。2、糖是焙烤食品的主要成分之一。在焙烤食品中，糖与蛋白质发生美拉德反应。使焙烤制品产生金黄色的颜色。这种颜色可增加人们的食欲感。同时也增加了食品的色、香、味。3、生理方面1）提供能量。2）构成细胞成分：糖与蛋白质结合成糖蛋白，糖蛋白都是构成软骨、骨骼等结缔组织的基质成分3）促进消化：果蔬中的纤维素、果胶虽不能被消化机体利用、但可促进胃肠蠕动和消化。但它分泌有助于正常消化和排便功能。,（三）测定意义（乳粉中还原糖测定意义）,(一）定义和分类 碳水化合物统称为糖类，是由碳、氢、氧三种元素组成的一大类化合物。糖+蛋白质糖蛋白 糖+脂肪糖脂 碳水化合物存在于各种食品的原料中（特别是植物性原料中）。作为食品工业的主要原料和辅助材料。,1.1 碳水化合物分类,在各种食品中存在形式和含量不一。糖分为单糖、双糖、多糖。有效碳水化合物人体能消化利用的单糖、双糖、多糖中的淀粉。无效碳水化合物多糖中的纤维素、半纤维素、果胶等不能被人体消化利用的。这些无效碳水化合物能促进肠道蠕动。,碳水化合物,1.2 测定方法,单糖和低聚糖,物理法,化学法,色谱法：纸色谱法、薄层色谱法、,酶法,相对密度法,折光法,旋光法,还原糖法（斐林氏法、高锰酸钾法、铁氰化钾法）,碘量法,缩合反应法,多 糖,淀粉：水解为单糖，再用单糖测定方法测定,果胶和纤维素：多采用重量法,食品中糖类物质的测定方法,直接滴定法法(改良的兰爱农法）高锰酸钾法 萨氏法 3，5二硝基水杨酸 酚硫酸法 蒽酮法 半胱氨酸咔唑法,化学法,还原糖法,碘量法,比色法,纸色谱 薄层色谱 GC HPLC 半乳糖脱氢酶测半乳糖、乳糖 葡萄糖氧化酶测葡萄糖 发酵法 测不可发酵糖 重量法测果胶、纤维素、膳食纤维素,色谱法,酶法,（一）提取 可溶性的游离单糖和低聚糖总称为糖类，如葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖。提取糖类时，一般将试样磨碎浸渍成溶液，用石油醚提取，除去其中的脂类和叶绿素。常用的糖类提取剂有水和乙醇的水溶液。1.水 糖类可用4050水作提取剂，如温度高时，将提出相当量的可溶性淀粉和糊精。水提取液中，除了糖类以外，还有蛋白质、氨基酸、多糖及色素等干扰物质，影响过滤时间和结果的准确度，所以还需要进行提取液的澄清。通常糖类及其制品、水果及其制品用水作提取剂。用水作提取剂应注意：（1）温度不可过高：防止可溶性淀粉及糊精提取出来。（2）酸性试样：水果中含有有机酸等酸性物质，可使蔗糖等低聚糖在加热时被部分水解（转化），所以水果及其制品等酸性试样提取时要用碳酸钙中和后提取即提取液应控制在中性。（3）萃取的液体：有酶活性时，同样是使糖水解，加入二氯化汞（HgCl2)抑制酶活性。,1.3 可溶性糖类的提取和澄清,1.3 可溶性糖类的提取和澄清,2.乙醇的水溶液 糖类在乙醇水溶液中具有一定溶解度，当提取液中乙醇体积分数70%时，蛋白质及淀粉、糊精等多数都不溶解，形成沉淀，故对于含大量淀粉、糊精的试样宜用乙醇提取。常用的提取液中乙醇的体积分数为7585(V/V)，若试样含水量较高，混合后的乙醇最终浓度应控制在上述范围。乙醇作提取液还可避免糖被酶水解。,提取液的制备方法要根据样的性状而定，但应遵循以下原则：取样量和稀释倍数的确定，要考虑所采用的分析方法的检测范围。一般提取经净化和可能的转化后，每毫升含糖量应在0.53.5mg之间，提取10克含糖2%的样品可在100毫升容量瓶中进行；而对于含糖较高的食品，可取510克样品于250毫升容量瓶中进行提取。,1.3 可溶性糖类的提取和澄清,(1)提取液的制备,含脂肪的食品，如乳酪，巧克力，蛋黄酱及蛋白杏仁糖等，通常需经脱脂后再以水进行提取。一般以石油醚处理一次或几次，必要时可以加热。每次处理后，倾去石油醚层（如分层不好，可以进行离心分离），然后用水提取。,含大量淀粉和糊精的食品，如粮谷制品，某些蔬菜，调味品，用水提取会使部分淀粉，糊精溶出，影响测定，同时过滤也困难，为此，宜采用乙醇溶液提取。乙醇溶液的浓度应高到足以使淀粉和糊精沉淀，通常用7075%的乙醇溶液。若样品含水量较高，混合后的最终浓度应控制在上述范围内。提取时可加热回流，然后冷却并离心，倾出上清液，如此提取23次，合并提取液，蒸发除去乙醇。用乙醇溶液作提取剂时，提取液不用除蛋白质，因为蛋白质不会溶解出来。,含酒精和二氧化碳的液体样品，通常蒸发至原体积1/31/4，以除去酒精和二氧化碳。但酸性食，在加热前应预先用氢氧化钠调节样品溶液至中性，以防止低聚糖被部分水解。,提取固体样品时，为提高提取效果，有时需加热，加热温度一般控制在4050，一般不超过80，温度过高时右溶性多糖溶出，增加下步澄清工作的负担，用乙醇做提取剂，加热时应安装回流装置。,试样经水或乙醇提取后，提取液中除含可溶糖外，还含有一些干扰物质，如单宁、色素、蛋白质、有机酸、氨基酸等，这些物质的存在使提取液带有色泽或呈现浑浊影响滴定终点，因此提取液均需要进行澄清处理，即加入澄清剂，使干扰物质沉淀而分离。澄清剂要求：作为糖类提取液的澄清剂必须能够完全地除去干扰物质，不吸附糖类，也不改变糖类的理化性质；同时，残留在提取液中的澄清剂应不干扰分析测定或很容易除去。常用的澄清剂有以下几种：1.中性醋酸铅pb(Ac)23H2O 能除去蛋白质、单宁、有机酸、果胶、还能凝聚其他胶体，作用可靠，不会使还原糖从溶液中沉淀出来，在室温下也不会形成可溶性糖。但它脱色力差，不能用于深色糖液的澄清。适用于植物性试样、浅色糖及糖浆制品、果蔬制品、焙烤制品等。缺点：脱色力差，不能用于深色糖液的澄清，否则加活性炭处理。2.碱性醋酸铅 能除去蛋白质、色素、有机酸，又能凝聚胶体，但它可形成较大的沉淀，可带走还原糖，特别是果糖。过量的碱性醋酸铅可因其碱度及铅糖的形成而改变糖类的旋光度，可用于深色的蔗糖溶液的澄清。缺点：沉淀颗粒大，可带走果糖。,（2）提取液的澄清,3.醋酸锌溶液和亚铁氰化钾溶液 澄清效果良好，生成的亚铁氰酸锌沉淀（白色），可带走蛋白质，发生共同沉淀作用，适用于色泽较浅、富含蛋白质的提取液(如乳制品)的澄清，常用于沉淀蛋白质，对乳制品最理想。4.硫酸铜溶液和氢氧化钠溶液 二者合并使用生成氢氧化铜，沉淀蛋白质，可作为牛乳试样的澄清剂。5.氢氧化铝 能凝聚胶体，但对非胶态物质澄清效果不好，可用作较色溶液的澄清剂，或作为附加澄清剂。6.活性炭 能除去植物性试样中的色素，但在脱色的过程中，伴随的蔗糖损失较大。对于质量浓度为0.2g/100mL的糖溶液,若使用动物活性炭0.5g进行脱色,不论左旋糖或右旋糖,被吸附的损失很少,但用动物性活性炭,则这些糖将被吸附损失6%8%。,澄清剂的使用,澄清剂的种类很多，性能也各不相同，应根据提取液的性质、干扰物质的种类、含量以及所采用的糖的测定方法，加以适当的选择。澄清剂的用量在实际工作中避免使用过多的澄清剂。过量的澄清试剂会使分析结果出现失真的现象。使用铅盐作为澄清剂时，用量不宜过大，当试样溶液在测定过程进行加热时，铅与还原糖（果糖）反应，生成铅糖产生误差，使测得糖量降低。可加入除铅剂如草酸钾（K2CrO4）、草酸钠（Na2CrO4）、硫酸钠（Na2SO4）、磷酸氢二钠（Na2HPO4）等来减少误差，使用时加少量固体即可。,还原糖是一般糖类定量的基础。GB/T 5009.7-2008食品中还原糖的测定中有两种方法:第一法直接滴定法、第二法高锰酸钾滴定法（一）直接滴定法1、原理 试样经除去蛋白质后，在加热条件下，以次甲基蓝作指示剂，直接滴定已经标定过的碱性酒石酸铜溶液(用还原糖标准溶液标定碱性酒石酸铜溶液)，还原糖将溶液中的二价铜还原成氧化亚铜。以后稍过量的还原糖使次甲蓝指示剂褪色，表示终点到达。根据试样溶液消耗体积，计算还原糖量。反应过程如下：,三、食品中还原糖的测定,（1）将一定量的碱性酒石酸铜甲液、乙液等量混合，甲液中的CuSO4与乙液中的NaOH反应立即生成天蓝色的氢氧化铜沉淀；CuSO4+2NaOH Cu(OH)2+Na2SO4（天蓝色）（2）天蓝色的氢氧化铜沉淀很快与乙液中的酒石酸钾钠反应，生成深蓝色的可溶性的酒石酸钾钠铜配合物。COONa COONa CHOH CHO+Cu(OH)2=Cu（深蓝色、可溶性）+2H2OCHOH CHO COOK COOK,（3）在加热条件下，以次甲基蓝作为指示剂，用除蛋白质后的试样溶液进行滴定，试样溶液中的还原糖与酒石酸钾钠铜反应，生成红色的氧化亚铜沉淀。COONa COONa CHO CHO CHO CHOH 6 Cu+(CHOH)4+6H2O6+(CHOH)4+3Cu2O CHO CHOH CH2HO CH2OH COOK COOK（4）待二价铜全部被还原后，稍过量的还原糖把次甲基蓝还原成为其隐色体，溶液蓝色消失，即为终点，根据试样溶液消耗量可计算还原糖含量。亚甲蓝氧化型+还原糖亚甲蓝还原型（C16H18ClN3S3H2O）(蓝色)（无色）,注：（1）此法所用的氧化剂碱性酒石酸铜的氧化能力较强，醛糖和酮糖都能被氧化，所测得是总还原糖含量。（2）直接滴定法对还原糖进行定量的基础是碱性酒石酸铜溶液中 Cu2+的量，所以，试样处理时不能采用铜盐作为澄清剂。（3）在碱性酒石酸铜乙液中加入亚铁氰化钾，是为了使之与Cu2O生成可溶性的无色络合物，而不再析出红色沉淀，使终点便于观察。其反应式如下：Cu2O+K4Fe(CN)6+H2O=K2Cu2Fe(CN)6+2KOH（4）碱性酒石酸铜甲液和乙液应分别贮存，用时才混合，不能事先混合贮存。否则酒石酸钾钠铜配合物长期在碱性条件下会慢慢分解析出氧化亚铜沉淀，使试剂有效浓度降低。,（5）次甲基蓝本身也是一种氧化剂，其氧化型为蓝色，还原型为无色；但在测定条件下，它的氧化能力比Cu2+弱，故还原糖先与Cu2+反应，Cu2+完全反应后，稍微过量一点的还原糖将次甲基蓝指示剂还原，使之由蓝色变为无色，指示滴定终点。,实际上，还原糖在碱性溶液中与硫酸铜的反应并不完全符合以上关系，还原糖在此反应条件下将产生降解，形成多种活性降解产物，其反应过程极为复杂，并非反应方程式中所反映的那么简单。在碱性及加热条件下还原糖将形成某些差向异构体的平衡体系。,(1)盐酸。(2)碱性酒石酸铜甲液：称取15g硫酸铜(CuSO45H2O)及0.05g次甲基蓝，溶入水中并稀释至1000mL。(3)碱性酒石酸铜乙液：称取50g酒石酸钾钠及75g氢氧化钠，溶于水中，再加入4g亚铁氰化钾，完全溶解后，用水稀释至1000mL，贮存于橡胶塞玻璃瓶内。(4)乙酸锌溶液：称取21.9g乙酸锌，加3mL冰乙酸，加水溶解并稀释至100mL。(5)亚铁氰化钾溶液：称取10.6g亚铁氰化钾，加水溶解并稀释至100mL。(6)葡萄糖标准溶液：准确称取1.000g经过962干燥2h的纯葡萄糖，加水溶解后加入5mL盐酸，并以水稀释至1000mL。此溶液每1mL相当于1.0mg葡萄糖。(7)果糖标准溶液：按葡萄糖标准溶液的配制操作，配制每mL标准溶液相当于1.0mg的果糖。(8)乳糖标准溶液：按葡萄糖标准溶液的配制操作，配制每mL标准溶液相当于1.0mg的乳糖(含水)。,2、试剂,(9)转化糖标准溶液：准确称取1.0526g纯蔗糖，用100mL水溶解，置于具塞三角瓶中加5mL盐酸(1+1)在6870水浴中加热15min，放置至室温定容至1000mL，每1mL标准溶液相当于1.0mg转化糖。3、仪器分析天平；牛角匙（合用）50mL小烧杯，1个/组；250mL容量瓶，1个/组；100mL量筒，1个/2组；250mL锥形瓶3只/组50mL碱式滴定管1支/组 5mL移液管4支/2组；10mL移液管1支/2组；干燥滤纸3张，漏斗1个/组小玻璃棒1根/组 玻璃珠：9颗电炉：每2组一台（带石棉网）,（1）试样处理乳类、乳制品及含蛋白质的冷食类：称取约2.50g5.00g固体试样（或吸取25.00mL50.00mL液体试样），置于250mL容量瓶中，加50mL水，摇匀后慢慢加入5mL乙酸锌溶液，混匀放置片刻，加入5mL亚铁氰化钾溶液，加水至刻度，混匀，沉淀、静置30min，用干燥滤纸过滤，弃去初滤液，滤液备用。酒精性饮料：吸取100.0mL试样，置于蒸发皿中，用氢氧化钠(40g/L)溶液中和至中性，在水浴上蒸发至原体积的1/4后，移入250mL容量瓶中,加水至刻度。含大量淀粉的食品：称取10.00g20.00g试样，置于250mL容量瓶中，加200mL水，在45水浴中加热1h，并时时振摇。冷却后加水至刻度，混匀，静置、沉淀。吸取20mL上清液于另一250mL容量瓶中，以下按自“慢慢加入5mL乙酸锌溶液”起依法操作。汽水等含有二氧化碳的饮料：吸取100.0mL试样置于蒸发皿中，在水浴上除去二氧化碳后，移入250mL容量瓶中，并用水洗涤蒸发皿，洗液并入容量瓶中，再加水至刻度，混匀后，备用。,4、测定方法,（2）标定碱性酒石酸铜溶液：吸取碱性酒石酸铜甲液和乙液各5.0mL，置于150mL锥形瓶中，加入水10mL，玻璃珠2粒。从滴定管中加约9mL葡萄糖标准液，控制在2min内加热至沸腾，趁热以每两秒一滴的速度继续滴加葡萄糖标准液或其他还原糖标准溶液，直至蓝色刚好褪去为终点。记录消耗的葡萄糖标准溶液或其他还原糖标准溶液的总体积。平行操作三份，取其平均值。计算10mL（甲、乙液各5mL）碱性酒石酸铜液相当于葡萄糖或其它还原糖的质量（mg）。式中：A10mL（甲、乙液各5mL）碱性酒石酸铜溶液相当于葡萄糖的质量(mg)；C葡萄糖标准溶液的浓度，mg/mL；V标定时消耗葡萄糖标准溶液的体积，mL。,【为什么要在沸腾状态下完成滴定？】,滴定时要保持沸腾状态，使上升蒸汽阻止空气侵入滴定反应体系中，一方面，加热可加快还原糖与Cu2+的反应速度；另一方面，加热可防止空气进入，避免氧化亚铜和还原型的次甲基蓝被空气氧化从而使得耗糖量增加。次甲基蓝的变色反应是可逆的，还原型次甲基蓝遇到空气中的氧时又会被氧化为其氧化型，再变为蓝色。此外，氧化亚铜也极不稳定，容易与空气中的氧结合而被氧化，从而增加还原糖的消耗量。,吸取碱性酒石酸铜甲液及乙液各5.0mL，置于150mL锥形瓶中，加水10mL，玻珠2粒，控制在2min内加热至沸，趁热以先快后慢的速度，从滴定管中滴加试样处理液，并保持溶液沸腾状态，等溶液蓝色变浅时，以每两秒1滴的速度滴定，直至蓝色刚好褪去为终点，记录消耗的试样溶液体积。当样液中还原糖浓度过高时，应适当稀释，再进行正式滴定，使每次滴定消耗样液的体积控制在与标定碱性酒石酸铜溶液时所消耗的还原糖标准溶液的体积相近，约在10mL左右。,（3）试样溶液预测,当浓度过低时，则采取直接加入10.0mL试样液，免去加水10mL，再用还原糖标准溶液滴定至终点，记录消耗的体积（A）与标定时消耗的还原糖标准溶液体积（B）之差相当于10mL样液中的还原糖的量（C）。A+C=B C=B-A,想一想：为什么要进行预测？,预测定的目的：对试样溶液中还原糖浓度有一定要求（1mg/mL 左右），测定时试样溶液的消耗体积应该与标定葡萄糖标液的消耗体积相近，通过测定了解试样浓度是否合适，浓度过大或过小应该加以调整，使测定时消耗试样溶液量在10mL左右；二是通过测定可知道此溶液的大概消耗量，以便在正式的滴定时，预先加入比实际用量少1mL左右的样液，只留下1mL左右的样液在继续滴定时加入，以便保证在1min内完成续滴定工作，提高了测定的准确度。,吸取碱性酒石酸铜甲液及乙液各5.0mL，置于150mL锥形瓶中，加水10mL，玻珠2粒，从滴定管中加比预测体积少1mL的试样溶液，控制在2min内加热至沸腾，趁热以每两秒一滴的速度继续滴定，至蓝色刚好褪去为终点。记录消耗的试样溶液的总体积。同法平行操作三份，得出平均消耗体积。5、结果计算式中：X还原糖质量分数（g/100g)；m试样质量，g；A10mL碱性酒石酸铜溶液相当于还原糖（以葡萄糖计）的质量(mg)；250试样处理液总体积(mL)；V测定时消耗的试样处理液体积（mL）。计算结果：还原糖含量大于等于10g/100g时保留三位有效数字；还原糖小于10g/100g时，保留两位有效数字。,（4）试样溶液滴定,（1）还原糖在碱性溶液中与硫酸铜的反应并不符合当量关系，还原糖在此反应条件下将产生降解，形成多种活性降解物，反应过程极为复杂，并非如反应中所反应的那么简单。在碱性及加热条件下，还原糖将形成某些差向异构体的平衡体系。如D-葡聚糖向D-甘露糖、D-果糖转化，构成三种物质的平衡混合物，及一些烯醇式中间体，如1，2-烯二醇，2，3-烯二醇，3，4-烯二醇等。这些中间体可进一步促进葡萄糖的异构化，同时可进一步降解形成活性降解物，从而构成了整个反应的平衡体系。构成平衡体系的组分及含量，与实验条件有关，如碱度、加热程度等。但实践证明，只要严格遵守实验条件，分析结果的准确度及精密度是可以满足分析要求的。,6、说明,（2）直接滴定法测定还原糖的关键控制条件,直接滴定法测定还原糖含量，反应液碱度、还原糖液浓度、滴定速度、热源强度及煮沸时间等都对测定精密度有很大的影响。溶液碱度愈高，二价铜的还原愈快，因此必须严格控制反应的体积，使反应体系碱度一致。试样液中还原糖的浓度不宜过高或过低，根据预测试验结果，调节试样中还原糖的含量在1mg/mL，与标准葡萄糖溶液的浓度相近；滴定速度过快，消耗糖量多，反之，消耗糖量少；煮沸时间短消耗糖多，反之，消耗糖液少；热源一般采用800W电炉，锥形瓶内反应液在2min内加热至沸腾。热源强度和煮沸时间应严格按照操作中规定的执行，否则，加热至煮沸时间不同，蒸发量不同，反应液的碱度也不同，从而影响反应的速度、反应进行的程度及最终测定的结果。,滴定时，先将所需体积的绝大部分先加入至碱性酒石酸铜试剂中，使其充分反应，仅留0.5mL1mL用滴定方式加入，而不是全部由滴定方式加入，其目的是使绝大多数试样溶液与碱性酒石酸铜在完全相同的条件下反应，减少因滴定操作带来的误差，提高测定精度。整个滴定过程一直保持沸腾状态；平行试验试样溶液的消耗量相差不应超过0.1mL；,（8）滴定终点蓝色褪去后，溶液呈现黄色，此后又重新变为蓝色，不应再进行滴定。因为亚甲蓝指示剂被糖还原后蓝色消失，当接触空气中的氧气后，被氧化重现蓝色。（9）还原糖与碱性酒石酸铜试剂反应速度较慢，必须在加热至沸的情况下进行滴定。为防止烧伤及便于滴定工作，可于管尖部加接一弯形尖管，并戴上手套操作。,影响直接滴定法测定还原糖测定结果准确度的因素有哪些？,此法中影响测定结果的主要操作因素是反应液碱度、热源强度，煮沸时间和滴定速度。反应的碱度直接影响Cu2+与还原糖反应的速度、反应进行的程度及测定结果。在一定范围内，溶液碱度越高，Cu2+的还原越快。因此，必须严格控制反应液的体积，标定和测定时消耗的体积应接近，使反应体系碱度一致。锥形瓶壁厚和热源的稳定程等，对测定精密度影响很大，因此，在标定、预测、测定过程中，其实验条件都应力求一致。热源温度应控制在使溶液在2min内加热达到沸腾状态，且所有测定均应保持一致。否则加热至沸腾所需时间不同，引起蒸发量不同，使反应碱度发生变化，从而引入误差。沸腾时间和滴定速度对结果影响也较大，一般沸腾时间短，消耗还原糖液多，反之，消耗还原糖液少；滴定速度过快，消耗还原糖时多，反之，消耗还原糖量少。1min内滴定结束；整个滴定过程一直保持沸腾状态；继续滴定至终点的体积（mL），应控制在0.5至1mL以内。,1、原理试样经除去蛋白质后，其中还原糖把铜盐还原为氧化亚铜，加硫酸铁后，氧化亚铜被氧化为铜盐，以高锰酸钾溶液滴定氧化作用后生成的亚铁盐，根据高锰酸钾消耗量，计算氧化亚铜的含量，再查表得还原糖量。（1）将一定量的试样溶液与过量的碱性酒石酸铜溶液反应，还原糖将Cu2+还原为氧化亚铜，过滤后，得到氧化亚铜沉淀；CuSO4+2NaOH=Cu(OH)2（天蓝色）+Na2SO4COONa COONa CHOH CHO+Cu(OH)2=Cu（深蓝色、可溶性）+2H2OCHOH CHO COOK COOKCOONa COONa CHO CHOCHO CHOH Cu+(CHOH)4+2H2O=2+(CHOH)4+Cu2O CHO CHOH CH2HO CH2OHCOOK COOK,（二）高锰酸钾滴定法,（2）向氧化亚铜沉淀中加入过量的酸性硫酸铁溶液，氧化亚铜被氧化溶解，而三价铁则被还原为亚铁盐；Cu2O+Fe2(SO4)3+H2SO42CuSO4+2FeSO4+H2O(3)再用高锰酸钾标准溶液滴定所生成的亚铁盐，根据高锰酸钾溶液消耗量可计算出氧化亚铜的量。再从检索表中查出与氧化亚铜量相当的还原糖量，即可计算出试样中还原糖含量。10FeSO4+2KMnO4+8H2SO45Fe2(SO4)3+2MnSO4+K2SO4+8H2O由反应式可见：5molCu2O相当于2mol的KMnO4，则氧化亚铜的g当量为：5143.08:2158.03=X:158.03/5X=71.54式中:158.03KMnO4摩尔质量;143.08Cu2O的摩尔质量；158.03/5KMnO4的mg当量。即:1mL高锰酸钾标准溶液c(1/5KMnO4)=1.000mol/L相当于71.54 mg氧化亚铜。故，已知高锰酸钾滴定量就可折算成氧化亚铜量，再由氧化亚铜相当还原糖量检索表查出相当于还原糖量。,3.试剂(1)碱性酒石酸铜甲液 称取34.639g硫酸铜(CuSO45H2O)，加适量水溶解，加0.5mL硫酸，再加水稀释至500mL，用精制石棉过滤。(2)碱性酒石酸铜乙液 称取173g酒石酸钾钠与50g氢氧化钠，加适量水溶解，并稀释至500mL，用精制石棉过滤，贮存于橡胶塞玻璃瓶内。【比较一下以上两种试剂与直接滴定法配制方法相同吗？】(3)精制石棉 取石棉先用盐酸(3mol/L)浸泡2d3d，用水洗净，再加氢氧化钠溶液(100g/L)浸泡2d3d，倾去溶液，再用热碱性酒石酸铜乙液浸泡数小时，用水洗净。再以盐酸(3mol/L)浸泡数小时，以水洗至不呈酸性。然后加水振摇，使成微细的浆状软纤维，用水浸泡并贮存于玻璃瓶中，即可用作填充古氏坩埚用。(4)高锰酸钾标准溶液(0.1000mol/L)。(5)氢氧化钠溶液(40g/L)称取4g氢氧化钠，加水溶解并稀释至100mL。(6)硫酸铁溶液 称取50g硫酸铁，加入200mL水溶解后，慢慢加入100mL硫酸，冷后加水稀释至1000mL。(7)盐酸(3mol/L)量取30mL盐酸，加水稀释至120mL。,2.仪器(1)25mL古氏坩埚或G4垂融坩埚。(2)真空泵或水泵。,由瓷土制成，使用时先将石棉绒均覆盖在坩埚的多孔底上（约1-2毫米厚），盖以多孔瓷板，再地瓷板上均匀覆盖一层石棉绒，烘干至恒重，即可供沉淀过滤和称重之用。自玻璃过滤坩埚出现后，这种坩埚则很少应用。,(1)试样处理 乳类、乳制品及含蛋白质的冷食类：称取2.00g5.00g固体试样(吸取25.00mL50.00mL液体试样)，置于250mL容量瓶中，加水50mL，摇匀后加10mL碱性酒石酸铜甲液及4mL氢氧化钠溶液(40g/L)，加水至刻度，混匀。静置30min，用干燥滤纸过滤，弃去初滤液，取中间滤液备用。碱性酒石酸铜甲液及4mL氢氧化钠溶液的作用是什么？酒精性饮料：吸取100.0mL试样，置于蒸发皿中，用氢氧化钠溶液(40g/L)中和至中性，在水浴上蒸发至原体积的1/4后，移入250mL容量瓶中,加50mL水，混匀。以下按自“加10mL碱性酒石酸铜甲液”起依法操作。含多量淀粉的食品：称取10.00g20.00g试样，置于250mL容量瓶中，加200mL水，在45水浴中加热1h，并时时振摇。冷后加水至刻度，混匀，静置。吸取200mL上清液于另一250mL容量瓶中，以下按自“加10mL碱性酒石酸铜甲液”起依法操作。汽水等含有二氧化碳的饮料：同直接滴定法,4.操作方法,吸取50.00mL处理后的试样溶液，于400mL烧杯内，加入25mL碱性酒石酸铜甲液及25mL乙液，于烧杯上盖一表面皿，加热，控制在4min内沸腾，再准确煮沸2min，趁热用铺好石棉的古氏坩埚或G4垂融坩埚抽滤，并用60热水洗涤烧杯及沉淀，至洗液不呈碱性为止。将古氏坩埚或垂融坩埚放回原400mL烧杯中，加25mL硫酸铁溶液及25mL水，用玻璃棒搅拌使氧化亚铜完全溶解，以高锰酸钾标准溶液 c(1/5KMnO4=0.1000mol/L)滴定至微红色为终点。同时吸取50mL水，加入与测定试样时相同量的碱性酒石酸铜甲液、乙液，硫酸铁溶液及水，按同一方法做空白试验。,(2)测定,（1）试样中还原糖质量相当于氧化亚铜的质量，按式(1)进行计算。A=(V-V0)c71.54(1)式中：A试样中还原糖质量相当于氧化亚铜的质量，mg；V测定用试样液消耗高锰酸钾标准溶液的体积，mL；V0试剂空白消耗高锰酸钾标准溶液的体积，mL；c高锰酸钾标准溶液的实际浓度，mol/L；71.541mL高锰酸钾标准溶液c(1/5KMnO4)=1.000mol/L相当于氧化亚铜的质量，mg。,5.结果计算,（2）根据式(1)中计算所得氧化亚铜质量，查附表八相当于氧化亚铜质量的葡萄糖、果糖、乳糖、转化糖的质量表，再计算试样中还原糖含量，按式(2)进行计算。(2)式中：X试样中还原糖的含量，g/100g；m1查表得还原糖的质量，mg；m试样质量或体积，g或mL；V测定用试样溶液的体积，mL；250试样处理后的总体积，mL。计算结果大于等于10g/100g时保留三位有效数字，小于10g/100g时保留两位。在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%,（1）此法以高锰酸钾滴定反应过程中产生的定量的硫酸亚铁为结果计算的依据，因此，在试样处理时，不能用乙酸锌和亚铁氰化钾作为糖液的澄清剂，以免引入Fe2+，造成误差。（2）测定时必须严格按规定的操作条件进行，必须使加热至沸腾时间及保持沸腾时间严格保持一致。即必须控制好热源强度，保证在加入碱性酒石酸铜甲、乙液后，在4min内加热至沸，并使每次测定的沸腾时间保持一致，否则误差较大。（3）此法所用碱性酒石酸铜溶液是过量的，即保证把所有的还原糖全部氧化后，还有过剩的Cu2+存在，所以，煮沸后的反应液应呈蓝色。如煮沸过程中如发现溶液蓝色消失，说明糖液浓度过高，应减少试样溶液取用体积，重新操作，不能增加酒石酸铜甲、乙液用量。（4）试样中既有单糖又有麦芽糖或乳糖时，还原糖测定结果偏低，主要是由于麦芽糖、乳糖分子量大，只有一个还原糖所致。（5）抽滤时要防止氧化亚铜沉淀暴露在空气中，应使沉淀始终在液面以下，以免被氧化。,6、说明,（6）本法适用于各类食品中还原糖的测定，有色试样溶液也不受限制。此法的准确度高，重现性好，准确度和重现性都优于上述的直接滴定法，但操作复杂、费时。（7）垂熔滤器又称玻砂滤器，是利用玻璃粉末烧结制成多孔性滤片，再焊接在具有相同或相似膨胀系数的玻壳或玻管上。按滤片平均孔径大小分为六个号，用以过滤不同的沉淀物。见下表：新滤器用前要用热盐酸或铬酸洗液抽滤,并用立即用水冲净,除去滤器中的灰尘等杂质.禁止过滤浓氢氟酸,热浓磷酸及浓碱液,因为这些试剂可溶解滤片的微粒,使滤孔增大并造成滤片脱裂。,每次用毕或使用一段时间以后,必须进行及时有效的清洗，洗涤方法有机械冲洗法和化学洗涤法。机械冲洗法是将滤器倒置，从过滤的相反方向用蒸馏水反复冲洗，如采用减压法，可提高洗涤效率。化学洗涤法是针对不同沉淀物，采用各种有效洗涤液洗涤或浸泡，再用水冲净，晾干即可。常用洗涤液的洗涤范围如下表,1.原理 将一定量的样液与过量的碱性铜盐溶液共热，样液中的还原糖定量地将二价铜还原为氧化亚铜，生成的氧化亚铜在酸性条件下溶解为一价铜离子，并能定量地消耗游离碘，碘被还原为碘化物，而一价铜被氧化为二价铜。剩余的碘用硫代硫酸钠标准溶液滴定，同时做空白试验，根据硫代硫酸钠标准溶液消耗量可求出与一价铜反应的碘量，从而计算出样品中还原糖含量。各步反应式如下：2Cu+I2=2Cu2+2 I-I2+2 Na2S2O3=Na2S4O6+2 NaI,(三)萨氏(Somogyi)法,1.碘量法(1)原理 样品经处理后，取一定量样液于碘量瓶中，加入一定量过量的碘液和过量的氢氧化钠溶液，样液中的醛糖在碱性条件下被碘氧化为醛糖酸钠，由于反应液中碘和氢氧化钠都是过量的，两者作用生成次碘酸钠残留在反应液中，当加入盐酸使反应液呈酸性时，析出碘，用硫代硫酸钠标准溶液滴定析出的碘，则可计算出氧化醛糖消耗的碘量，从而计算出样液中醛糖的含量。,(四)其他方法简介,醛糖+I2+3 NaOH=醛糖酸钠+2 NaI+2H2OI2+2 NaOH=NaIO+NaI+H2ONaIO+NaI+2 HCl=I2+2 NaCl+H2O(2)适用范围 本法用于醛糖和酮糖共存时单独测定醛糖。适用于各类食品，如硬糖、异构糖、果汁等样品中葡萄糖的测定。,2、砷钼酸比色法 原理：还原糖含有醛基和酮基，在碱性溶液中能还原铜试剂中的二价铜成一价氧化亚铜，砷钼酸试剂中六价钼被氧化亚铜还原生成钼蓝，钼蓝溶液在560nm下的吸光度与还原糖浓度呈正比例关系。按不同程序水解，从而可测出非还原糖及淀粉含量。,步骤：绘制葡萄糖标准曲线 样品溶液制备,水提取,离心液,还原糖和非还原糖测定,沉淀物,酸水解,加铜试剂和砷钼酸试剂,加铜试剂和砷钼酸试剂，比色测定,酸水解后再加铜试剂和砷钼酸试剂,得到还原糖含量,得到非还原糖含量,得到淀粉含量,3、3,5-二硝基水杨酸法,原理：在NaOH和丙三醇存在下，3,5-二硝基水杨酸（DNS）与还原糖供热后被还原生成氨基化合物。这种呈橘红色的化合物在540nm波长处有最大吸收，在一定的浓度范围内，还原糖的量与光吸收值呈线性关系。因此，利用可利用比色法测定样品中的含糖量。,(一)蔗糖的测定在食品生产过程中，测定蔗糖的含量可以判断食品加工原料的成熟度，鉴别白砂糖、蜂蜜等食品原料的品质，以及控制糖果、果脯、加糖乳制品等新产品的质量指标。蔗糖是葡萄糖和果糖组成的双糖，没有还原性，但在一定条件下，蔗糖可水解成具有还原性的葡萄糖和果糖。因此，可以用测定还原糖的方法测定蔗糖含量。对于浓度较高的蔗糖溶液，其相对密度、折光率、旋光度等物理常数与蔗糖浓度都有一定关系，故可用物理检验法测定蔗糖的含量。本节介绍盐酸水解法。,四、蔗糖和总糖的测定,1.原理,试样经除去蛋白质后，其中蔗糖经盐酸水解转化为还原糖，再按还原糖测定。水解前后还原糖的差值为蔗糖水解所产生的还原糖的量，再乘以换算系数0.95即为蔗糖含量。HCLC12H22O11+H2O C6H12O6+C6H12O 蔗糖 葡萄糖 果糖根据蔗糖的水解反应，蔗糖的相对分子质量为342，水解后生产2分子单糖，相对分子质量之和为360，故由转化糖的含量换算成蔗糖的含量时应乘以换算系数342/360=0.95。2.仪器（同食品中还原糖的测定方法直接测定法）酸式滴定管:25mL、可调电炉（带石棉板）等,(1)盐酸(1+1)量取50mL盐酸用水稀释至100mL。(2)氢氧化钠溶液(200g/L)。(3)甲基红指示液 称取甲基红0.10g，用少量乙醇溶解后，并稀释至100mL。其余试剂同食品中还原糖的测定方法-直接测定法。(1)盐酸。(2)碱性酒石酸铜甲液：称取15g硫酸铜(CuSO45H2O)及0.05g次甲基蓝，溶入水中并稀释至1000mL。(3)碱性酒石酸铜乙液：称取50g酒石酸钾钠及75g氢氧化钠，溶于水中，再加入4g亚铁氰化钾，完全溶解后，用水稀释至1000mL，贮存于橡胶塞玻璃瓶内。(4)乙酸锌溶液：称取21.9g乙酸锌，加3mL冰乙酸，加水溶解并稀释至100mL。(5)亚铁氰化钾溶液：称取10.6g亚铁氰化钾，加水溶解并稀释至100mL。(6)葡萄糖标准溶液：准确称取1.