流式细胞仪(2014年).ppt

1,流 式 细 胞 仪,流式细胞仪（flow cytometer，FCM）是以激光为光源、检测生物学颗粒理化性质的仪器。生物学颗粒包括大的免疫复合物、DNA、RNA、染色体、蛋白质、脂质体、细胞器、病毒颗粒、细菌、真菌、真核细胞、杂交细胞、聚集细胞等。理化性质包括细胞大小、细胞形状、细胞膜完整性、胞浆颗粒化程度、DNA含量、总蛋白含量、酶活性等。,2,流 式 细 胞 仪-流式细胞术,流式细胞术（flow cytometry，FCM）流式细胞术是应用流式细胞仪对悬浮液中的细胞或细胞器进行快速测量和多参数检测的细胞分析技术。同时依赖测量到的参数还可以用物理的方法将一个群体中的细胞亚群分选出来，即流式细胞分选术（cell sorting）。流式细胞术综合应用了激光技术、流体力学、细胞生物化学技术、荧光标记技术、单克隆抗体技术、分子生物学技术、计算机技术及临床医学等多门技术。,3,流 式 细 胞 仪-发展历史,流式细胞仪的发展历史1934年，Moldavan使悬浮的红细胞从一个毛细玻璃管中流过，每个通过的细胞可被一个光电装置记录下来。这就是流式细胞仪的雏形。1965年，Kamentsky用紫外吸收和可见光散射两个参数同时测量未染色细胞，给出细胞中核酸的含量和细胞大小。奠定了多参数流式细胞测量的基础。,4,流 式 细 胞 仪-发展历史,1967年，Van Dilla和Los Alamos采用了层流流动室和氩激光器，开发出了液流束、照明光轴、检测系统三者相互垂直的流式细胞仪。这成为目前各种流式细胞仪的基础。1969年，Fulwyler利用静电墨水喷射液滴偏转技术，建立了流式细胞分选术。Ehrlich和Wheeless利用飞点扫描技术和缝扫描技术使零分辨率的流式细胞仪变成了低分辨率的流式细胞仪。,5,流 式 细 胞 仪-发展历史,20世纪70年代，随着Kohler和Milstein成功提出了单克隆抗体技术和荧光标记技术，为特异研究和分析细胞奠定了良好的基础。1973年，美国BD公司和美国斯坦福大学合作，研制开发并生产了世界上第一台商用流式细胞仪FACS I。,6,流 式 细 胞 仪-发展历史,20世纪80年代，流式细胞仪的数据采集、存储、显示、分析日趋完善，随着样品制备方法的增加，新的荧光染料和细胞标记物的出现，使流式细胞仪的应用范围逐渐扩大。20世纪90年代，与之配套的标本制备仪和自动进样器的问世，以及适合临床应用的单克隆抗体的增加，使流式细胞仪逐渐从科研单位进入医院的中心实验室和检验科，成为现代化的临床检验仪器的一部分。,7,流 式 细 胞 仪-发展历史,目前，流式细胞仪同时朝着更加专业化和更加普及化的两个不同的方向发展。更加专业化是指仪器更精密、更灵敏地进行更多参数的分析和更快、更纯地进行细胞分选。更加普及化是指仪器更易于使用，使之成为实验室里更常用的仪器。,8,流式细胞仪-特点,FCM与其他细胞分析技术相比，有如下特点：高速度：每秒可检测1 0005 000个细胞。高灵敏度：每个细胞只要带有1 0003 000个荧光分子就能检出，两个细胞之间有5%的差别就可区分出来，光散射的灵敏度为0.3um。高精度：在细胞悬液中测量细胞，比其他分析技术的变异系数更小，分辨率高。高纯度：分选细胞的纯度可大于99%以上。多参数：可同时定量检测单个细胞的DNA等多个参数。在适当的条件，可对活细胞进行无害性分析和分选。,9,流式细胞仪-分类,流式细胞仪的分类根据功能不同，可分为临床型和综合型（科研型）。根据有无细胞分选功能，可分为流式细胞分析分选仪和流式细胞分析仪。根据结构不同，可分为一般流式细胞仪（零分辨率流式细胞仪）和狭缝扫描流式细胞仪（高分辨率流式细胞仪）。前者的激光光斑为椭圆形，光斑直径大于被检细胞体积。后者激光光束为一条线状扁平光斑，直径在35um。,10,流 式 细 胞 仪-学习内容,流式细胞仪的基本原理流式细胞仪的基本结构流式细胞仪的性能指标流式细胞仪的使用流式细胞仪的应用流式细胞仪实例,11,I 流式细胞仪的基本原理,基本原理：将悬浮分散的单细胞悬液，经特异性荧光染料染色 后，放入样品管。在气体压力的作用下，悬浮在样品管中的单细胞悬液形成样品流垂直进入流式细胞仪的流动室，流动室充满鞘液，在鞘液的约束下，细胞排列成单列由流动室的喷嘴喷出，成为细胞液柱，液柱与水平方向的入射激光束垂直相交，相交点称为测量区。通过测量区的细胞受激光照射后发出荧光，同时产生光散射。这些信号分别被成90角方向放置的光电倍增荧光检测器和前向角放置的光电二极管检测器接收，经过转换器转换为电子信号。电子信号经模/数转换输入计算机。计算机通过相应的软件储存、计算、分析，就可以得到细胞的大小和活性、核酸含量等理化指标。,示意图,12,I 流式细胞仪的基本原理,细胞分选原理：在压电晶体上加上频率为30kHz的信号，使之产生同频率的机械振动，流动室也随之振动，这样通过测量区的液柱断裂成一连串均匀的液滴。在细胞形成液滴以前，各类细胞的特性已在测量区被测定并储存。如果其特性与要分选的细胞相同时，仪器就在这类细胞形成液滴时给该液滴充与指定的电荷，这样，当被选定的细胞形成液滴时就带有特定的电荷，未被选定的细胞形成的细胞液滴及不含细胞的空白液滴不被充电，也就不带电荷。带有电荷的液滴向下落入偏转板间的静电场时，依据所带电荷符号向左或向右偏转，落入指定的收集器内，不带电荷的液滴不发生偏转，垂直落入废液槽中排出，从而实现细胞的分类。,13,I 流式细胞仪的基本原理,荧光染色原理 免疫荧光染色：细胞膜上或细胞内的抗原分子与相应的荧光素标记McAb作用一定时间后形成带有荧光素的抗原抗体复合物，经激光激发后发出特定的荧光，其荧光强度与被测定抗原分子含量呈比例关系，由此可求得被测细胞与标记McAb相对应抗原的表达量和阳性细胞百分比。常用的荧光染料有异硫氰酸荧光素（FITC）、藻红蛋白（PE）、别藻青蛋白（APC）和Perdinin叶绿素（PerCP）等，经488nm激光激发后其发射荧光光谱有差别，因而可将其用于标记不同的McAb进行单色或多色免疫荧光染色。目前，流式细胞术有单色、双色、三色、四色、五色荧光分析，对细胞的分析更加精密、深入。,14,I 流式细胞仪的基本原理,免疫荧光染色常用方法：直接免疫荧光法：用一种（单色）或者多种（多色）荧光素标记的McAb染色细胞后测量其荧光强度和阳性细胞数。间接免疫荧光法：用一种McAb与细胞作用后，洗去未结合McAb，再加入荧光素标记的第二抗体（如羊抗鼠IgG-FITC），染色细胞后测量其荧光强度及阳性细胞数。,15,I 流式细胞仪的基本原理,荧光染色原理普通荧光染色：用荧光染料直接染细胞中相应的成分。如核酸染色。核酸染色：多种荧光染料如碘化丙啶（PI）、赫斯特（hoechst，HO）、色霉素A3（CA3）等可与DNA分子结合，其中以PI最常用。PI可选择性地嵌入DNA分子双螺旋的碱基之间，经激光激发后发出橙红色荧光，其荧光强度与细胞DNA分子含量成比例关系，可用于DNA倍体及细胞周期分析。,16,I 流式细胞仪的基本原理,单色直接免疫荧光染色,17,I 流式细胞仪的基本原理,单色直接免疫荧光染色：异硫氰酸荧光素（FITC）分子标记McAb直接荧光染色后，荧光显微镜下可见发射绿色荧光的阳性细胞。,18,I 流式细胞仪的基本原理,双色直接免疫荧光染色,19,I 流式细胞仪的基本原理,双色直接免疫荧光染色：异硫氰酸荧光素（FITC）和藻红蛋白（PE）两种荧光素分子标记的McAb直接荧光染色后，荧光显微镜下可见绿色荧光（FITC）、橙红色荧光（PE）和黄绿色荧光（FITC和PE双染色）的三种阳性细胞。,20,I 流式细胞仪的基本原理,三色直接免疫荧光染色,21,I 流式细胞仪的基本原理,三色直接免疫荧光染色：用异硫氰酸荧光素（FITC）、藻红蛋白（PE）、别藻蓝蛋白（APC）三种荧光素标记的McAb直接荧光染色后，荧光显微镜下可见绿色（FITC）、橙色（PE）、红色（APC）和两种或三种染色混合的阳性细胞。,22,I 流式细胞仪的基本原理,核酸染色：细胞经透膜处理后，PI分子与细胞核中的DNA结合，在荧光显微镜下可见呈红色荧光的细胞核。,23,I 流式细胞仪的基本原理,+,-,样品液,鞘液,前向角散射光检测器,90角荧光检测器,氩激光光源,流动室,喷嘴,测量区,+,偏转板,样品管,收集器,图：工作原理示意图,24,I I 流式细胞仪的基本结构,流式细胞仪基本结构包括五部分：（）光源（）液流系统（）信号接收系统（）信号处理系统（）细胞分选器 以上整个系统由电子电路和计算机控制，用以收集、显示、分析、储存被测定的各种信号及控制细胞的分选收集。,25,I I 流式细胞仪的基本结构,光源,液流系统,信号接收,信号处理,细胞分选,图：流式细胞仪构成示意图,26,I I 流式细胞仪的基本结构（1）,光源流式细胞仪中使用的光源多为氩离子激光器。氩离子激光器是一种气体激光器，通过气体放电使氩离子电离并激发，实现粒子数反转而产生激光，谱线有十余条，其中绿光514nm和蓝光488nm两条谱线最强。选择哪条谱线作为激发光源，主要是依据荧光染料的激发光谱而定，越接近被其激发光谱的峰值，所产生的荧光信号越强。,27,I I 流式细胞仪的基本结构（1）,激光（Laser）光源 激光的特性良好的单色性单向性发散角小,28,I I 流式细胞仪的基本结构（）,液流系统液流系统是样品和鞘液（生理盐水或磷酸盐缓冲液）进入、流动、排出的通道。由氮气加压系统、鞘流瓶、样品管、流动室、喷嘴等组成。在高压氮的压力下，样品液进入样品管，在流动室与鞘液相混，以样品流居中、鞘液流包绕的流束形式到达经特殊设计的喷嘴，并以稳流的形式喷出，在喷嘴附近的测量区被测量后，形成液滴，进入分选器，未被分选的细胞和鞘液排入废液槽。,29,I I 流式细胞仪的基本结构（）,激光束,荧光检测器,散射光检测器,图：内检式流动室示意图,30,I I 流式细胞仪的基本结构（）,激光束,荧光检测器,散射光检测器,鞘液,图：在空气中检测流动室示意图,样品液,31,I I 流式细胞仪的基本结构（）,荧光显微镜,环状结构,鞘液,图：显微检测流动室示意图,样品液,32,I I 流式细胞仪的基本结构（）,图：四种典型流动室示意图（）,（1）,（2）,33,I I 流式细胞仪的基本结构（）,图：四种典型流动室示意图（2）,（3）,（4）,34,I I 流式细胞仪的基本结构（）,FACS Calibur 流式细胞仪的样品流动,35,I I 流式细胞仪的基本结构（）,信号接收系统 流式细胞仪主要接收细胞的散射光信号和荧光信号，并将其转换为与散射光和荧光强度成正比的电压脉冲。,36,I I 流式细胞仪的基本结构（）,细胞通过测量区时信号的产生,37,I I 流式细胞仪的基本结构（）,细胞通过测量区时信号的产生：电压脉冲的形成,38,I I 流式细胞仪的基本结构（）,散射光信号 细胞在通过激光测量区时，在空间360立体角的所用方向散射光线，散射光信号与细胞大小、形状、质膜及细胞内部的折射率有关。在流式细胞仪中，通常在前向角和侧向角接收和检测细胞散射光，前者的检测器多用 硅光电二极管，后者的检测器多用光电倍增管。,39,I I 流式细胞仪的基本结构（）,散射光信号 前向角散射光（forward scatter，FSC）：亦称小角散射或0散射。激光在此方向上有较强的衍射光，当用遮光板除去本底光的影响时，该方向上的散射光强度是d/的函数，表示激光波长，d表示细胞大小。FSC参数反映细胞的大小和尺寸。侧向角散射光（side scatter，SSC）：亦称大角散射或90散射。激光在此方向上衍射光明显减弱，而以反射光、散射光成分为主。SSC参数反映细胞内颗粒物质的大小和多少，可获取有关细胞内部的精细结构和颗粒性质的有关信息。,40,I I 流式细胞仪的基本结构（）,散射光信号,41,I I 流式细胞仪的基本结构（）,荧光信号（fluorescence，FL）被荧光染料染色的细胞在通过测量区时，细胞中的特异荧光染料受激发而产生荧光信号，其强度表示待检测物质的多少。荧光信号检测系统由滤片和检测器组成，与入射激光成90放置。滤片用以滤除非荧光信号；荧光检测器多用光电倍增管。荧光波长与激发光波长不同且强度转弱，须使用一系列灵敏的光学元件才能分离出不同的荧光信号。,42,I I 流式细胞仪的基本结构（）,荧光信号：细胞中荧光素含量与信号的关系,43,I I 流式细胞仪的基本结构（）,荧光信号：细胞中荧光素分布与信号的关系,44,I I 流式细胞仪的基本结构（）,信号处理系统 检测器以每秒10002000个细胞的速度探测细胞的散射光和荧光信息，经过A/D转换器变成二进制信号，储存于计算机中，每个细胞的光散射及荧光测量数据一般以列表或矩阵方式储存。计算机通过综合、处理、分析这些信息，可直接计算出所需结果。,45,I I 流式细胞仪的基本结构（）,电压脉冲定量分析与数字转换（1）,46,I I 流式细胞仪的基本结构（）,电压脉冲定量分析与数字转换（2）：脉冲高度,47,I I 流式细胞仪的基本结构（）,细胞信号的显示 一维直方图（histogram）单参数直方图表示一个参数与细胞数量间的关系。在图中，横坐标（X轴）表示荧光或散射光强度的相对值，其单位用在流式细胞仪中用“道（channel）”表示，道数与荧光强度之间是线性或对数关系，依仪器分析时放大器的性质而定。纵坐标（Y轴）通常代表细胞出现的频率或相对细胞数量，绝对细胞数较少使用。在直方图中，每个峰表示在某些方面性质相同的一群细胞，若用“标尺”把各峰分开成区间，即可统计分析出各个区间内细胞所占百分比、及光散射或荧光强度的峰值、平均值、标准差、变异系数等。,48,I I 流式细胞仪的基本结构（）,直方图,49,I I 流式细胞仪的基本结构（）,直方图,50,I I 流式细胞仪的基本结构（）,直方图,51,I I 流式细胞仪的基本结构（）,直方图标准荧光微球的荧光直方图：测试前必须用标准荧光微球校准仪器。,52,I I 流式细胞仪的基本结构（）,直方图T淋巴细胞单色直接免疫荧光染色的荧光直方图：以蓝色直方图为同型对照设定阴性与阳性细胞界标（Marker，M1），凡在M1左边的细胞为阴性，右边的细胞为阳性。,53,I I 流式细胞仪的基本结构（）,细胞信号分析的主要形式 二维点图（dot plot）二维点图表示两个参数与细胞数量间的关系。任选FSC、SSC、FL1FL3中两个参数为X轴和Y轴，就可得到二维点图。在二维点图中，每个点代表一个细胞，根据细胞性质的不同，在二维点图上就会出现若干群细胞，即为不同的细胞亚群。若用“门”把各亚群细胞分开并进行统计分析，可得各亚群细胞所占百分比、及平均荧光强度等。,54,I I 流式细胞仪的基本结构（）,二维点图,55,I I 流式细胞仪的基本结构（）,二维点图白细胞散射光FSC/SSC二维点图及二维密度图。,56,I I 流式细胞仪的基本结构（）,二维点图T细胞亚群CD3/CD4和CD3/CD8二维点图：CD3/CD4双阳性细胞（T辅助细胞）占45.04%。CD3/CD8双阳性细胞（T抑制细胞）占34.05%。,57,I I 流式细胞仪的基本结构（）,细胞信号分析的主要形式 假三维图及二维等高图（contour）假三维图：任选FSC、SSC、FL1FL3中任何两个参数为X轴和Y轴，以细胞数量为Z轴，就构成了三维图。因Z轴细胞数量不是直接测量参数，实际上仍是二维图，故称为假三维图。该图对细胞亚群的观察更为直观。二维等高图：用不同高度的平面切割假三维图，将这些切割投影到X、Y平面上，就形成了等高图，等高图由类似地图上的等高线组成，等高线密集的地方，就是细胞数变化快的地方。该图对观察细胞的分布趋势优于二维点图。,58,I I 流式细胞仪的基本结构（）,假三维图及等高图白细胞散射光FSC、SSC假三维图（左）与等高图（右）。,59,I I 流式细胞仪的基本结构（）,细胞信号分析的主要形式 三维图（3D）及四参数平面图三维图：在FSC、SSC、FL1FL3中任选三个参数为X轴、Y轴和Z轴，就构成了一个三维图，在三维空间中，每一群细胞各处于独立的空间位置。该图对复杂的细胞亚群分析更为直观、准确，但对其数据的统计分析较难。四参数平面图：四参数平面图分析对数据分布的观察也有一定意义。,60,I I 流式细胞仪的基本结构（）,三维图白细胞CD45、CD14、SSC三参数三维图：红色-淋巴细胞 黄色-嗜碱性粒细胞 天蓝-单核细胞 蓝色-中性粒细胞 品红-嗜酸性粒细胞,61,I I 流式细胞仪的基本结构（）,四参数平面图白细胞FSC、SSC、CD45、CD14、SSC四参数平面图：红色-淋巴细胞 黄色-嗜碱性粒细胞 天蓝-单核细胞 蓝色-中性粒细胞 品红-嗜酸性粒细胞。,62,I I 流式细胞仪的基本结构（）,细胞信号的分析散射光信号分析荧光信号分析散射光/荧光信号分析,63,I I 流式细胞仪的基本结构（）,散射光分析散射光（FSC、SSC）可用直方图、二维点图、假三维图、三维图等分析,A-白细胞 FSC直方图。B-白细胞 SSC直方图。C-白细胞 FSC/SSC二维图：可 分辨L、M、粒细胞。D-红细胞/血小板 FSC直方图。E-红细胞/血小板 SSC直方图。F-红细胞/血小板 FSC/SSC二维点图。,64,I I 流式细胞仪的基本结构（）,荧光分析荧光（FL1、FL2、FL3）可用直方图、二维点图等分析。,A-CD8直方图。B-CD3/SSC二维点图：设门，R1为CD3+T淋巴细胞。C-R1中CD3+T淋巴细胞 CD4/CD8二维图。D-FSC/SSC二维点图：设门，R2淋巴细胞分布区。E-R2中淋巴细胞 CD3/CD4二维点图。F-R2中淋巴细胞 CD3/CD8二维图。,65,I I 流式细胞仪的基本结构（）,细胞分选器：由水滴形成、分选逻辑电路、水滴充电及偏转这三部分组成。通过给压电晶体的振动使自喷嘴喷出的流束形成水滴，分选逻辑电路根据分选细胞的参数，给含有此参数的细胞液滴充电，充电的液滴经过电极偏转板时，依所带电荷的不同而偏向不同的电极板，在电极的下方放置收集容器，即可得到分选的细胞。,66,III 流式细胞仪的性能指标,荧光分辨率：表示仪器测量所能达到的最大精度，通常用变异系数表示。目前，仪器的荧光分辨率都在2%以下。荧光灵敏度：表示仪器所能检测到的最少荧光量，通常用能检测到的最少的异硫氰酸荧光素（FITC）分子来表示。一般仪器的荧光灵敏度为3000个FITC分子。前向角散射光灵敏度：以前向角散射光能检测到的最小颗粒直径表示。一般仪器可检测到的最小颗粒直径在0.3um左右。,67,III 流式细胞仪的性能指标,前向角散射光分辨率：用变异系数表示。一般约在2%，但多数厂家不给出此值。分析/分选速度：分析速度可达每秒500010000个细胞，分选速度为每秒5000个细胞通过测量去。实用时为保证分析或分选精度，常在每秒1000个以下。分选纯度：分选纯度不但与仪器精度有关，还与被分选的细胞亚群在整个群体中的相对位置有关。若被分选的亚群在直方图或二维点图上可清晰地分辨出来且与其他亚群无重叠，分选纯度就高，反之就低。,68,III 流式细胞仪的性能指标,分选收获率：是指通过测量区应被分选的细胞中实际落到指定收集器中的细胞数目所占的百分比。一般仪器在90%以上。分选收获率和分选纯度是相互制约的，纯度低，收获率就高，纯度高，收获率就低。除了以上7个参数外，还有其他指标，如样品浓度、同时可测参数、光源、喷孔尺寸、计算机配置等。,69,IV 流式细胞仪的使用,流式细胞仪的安装流式细胞仪的调校流式细胞仪的测试方法流式细胞仪的维护流式细胞仪的常见故障及排除,70,IV 流式细胞仪的使用,流式细胞仪的测试方法：一般包括5个步骤。制备合格的单细胞悬液。在FCM技术中，制备出合格的单个细胞悬液是最为关键的一个环节。对需测量的细胞生物化学成分进行荧光标记染色。进行流式细胞仪测量。对测量资料进行定量分析。对测量分析结果在生物学上的意义予以解释。,71,V 流式细胞仪的应用,流式细胞技术在细胞生物学中的应用流式细胞技术在免疫学中的应用流式细胞技术在肿瘤学中的应用流式细胞技术在血液学中的应用,72,V 流式细胞仪的应用,流式细胞仪在临床血液学中的应用白血病：血细胞形态学检查是白血病诊断的基础，白血病免疫学分型是对形态学分型的重要补充和进一步深化。白血病MICM分型认为免疫学分型对每一例急性白血病诊断都是必不可少的，对下列情况意义更大：用形态学、细胞化学染色不能肯定细胞来源的白血病。形态学为急性淋巴细胞白血病（ALL）或急性未分化白血病（AUL），但缺乏特异性淋巴细胞系列抗原标记。混合性白血病。部分髓系白血病。慢性淋巴细胞白血病。白血病微小残留病灶的检测。,73,V 流式细胞仪的应用,流式细胞仪在临床血液学中的应用白血病：目前，国际公认的免疫表型分析方法是流式细胞技术，其方法是利用荧光素标记的单克隆抗体（McAb）作为分子探针，多参数分析白血病细胞的细胞膜和细胞质或细胞核的抗原标记物，由此了解被测白血病细胞所属细胞系列及其分化程度。（）FCM白血病免疫分型。（）急性白血病微小残留病灶的监测。（）白血病细胞DNA分析。（）急性白血病多药耐药的检测。（）造血干/祖细胞移植,74,V 流式细胞仪的应用,流式细胞仪在临床血液学中的应用阵发性睡眠性血红蛋白尿症（PNH）：PNH是一种因红细胞的获得性缺陷致使红细胞对血清中补体敏感而发生的慢性血管内溶血。其发病机制是PNH异常血细胞的细胞膜缺乏糖化肌醇磷脂（GPI）锚连的蛋白，如CD55可抑制补体激活，CD59可抑制膜反应性溶解，其中CD59的缺乏对PNH溶血具有重要意义。用流式细胞仪检测细胞表面锚连蛋白CD55、CD59正取代传统的溶血检查方法而成为诊断PNH的有效工具。目前研究认为用CD59单克隆抗体检测红细胞表面的CD59表达其结果最令人满意，是诊断PNH较直接而又敏感可靠的方法。,75,V 流式细胞仪的应用,流式细胞仪在临床血液学中的应用血栓与出血性疾病：通过流式细胞仪来检测血小板表面的特异抗原与糖蛋白（GP），已成为血栓性疾病和一些出血性疾病的一个新的诊断方法。（1）在血栓性疾病中的应用 检测活化血小板：活化标志物CD62P、CD63等。测定血小板内钙流（2）在出血性疾病中的应用 特发性血小板减少性紫癜（ITP）血小板无力症（GP）巨大血小板综合征（BSS）贮存池病 血管性血友病（vWD）,76,V 流式细胞仪的应用,流式细胞仪在临床血液学中的应用网织红细胞和网织血小板的检测（1）网织红细胞（RET）：网织红细胞是无核的、胞质中含有残留RNA物质的、未完全成熟的红细胞。流式细胞技术中用荧光染料噻唑橙（TO）使RNA染色，再在流式细胞仪上检测，根据荧光的有无和荧光强度的高低，可测定出网织红细胞的百分率、绝对计数及分类。（2）网织血小板（RP）：网织血小板是指细胞质中残留有RNA物质的血小板。RP与RET一样都是刚从骨髓中释放出来的未成熟细胞，随着血小板的成熟，RP内的RNA逐渐消失。RP能够比较精确地反映骨髓中血小板的生成情况，测定方法与RET的FCM测定相似。,77,V 流式细胞仪的应用,应用举例（1）网织红细胞计数 原理：用荧光染料噻唑橙（TO）使RNA染色，再在流式细胞仪上检测，根据荧光的有无和荧光强度的高低，可测定出网织红细胞百分比。分析参数有：FSC、SSC、FL1。分析图形有：FSC/SSC二维图、FL1直方图等。,78,V 流式细胞仪的应用,网织红细胞计数正常人血液煌焦油蓝活体染色：可见颗粒型网织红细胞。,79,V 流式细胞仪的应用,网织红细胞计数正常人血液网织红细胞分析：在FSC/SSC二维图中设定红细胞门R1，血小板门R2。将阴性对照（绿色）与待测标本（红色）的FL1直方图重叠，设定界标（M1）,使阴性对照的非特异性荧光率小于0.3%。分析待测标本中的网织红细胞百分率为1.07%。,80,V 流式细胞仪的应用,网织红细胞计数IDA患者血液煌焦油蓝活体染色：网红增多，可见颗粒型和破网型。,81,V 流式细胞仪的应用,网织红细胞计数IDA患者网织红细胞分析：在FSC/SSC二维图中设定红细胞门R1，血小板门R2。将阴性对照（绿色）与待测标本（红色）的FL1直方图重叠，设定界标（M1）,使阴性对照的非特异性荧光率小于0.3%。分析待测标本中的网织红细胞百分率为4.78%。,82,V 流式细胞仪的应用,网织红细胞计数AA患者血液煌焦油蓝活体染色：网红很难见到。,83,V 流式细胞仪的应用,网织红细胞计数AA患者网织红细胞分析：在FSC/SSC二维图中设定红细胞门R1，血小板门R2。将阴性对照（绿色）与待测标本（红色）的FL1直方图重叠，设定界标（M1）,使阴性对照的非特异性荧光率小于0.3%。分析待测标本中的网织红细胞百分率为0.05%。,84,V 流式细胞仪的应用,网织红细胞计数HA患者血液煌焦油蓝活体染色：网红明显增多，可见各型。,85,V 流式细胞仪的应用,网织红细胞计数HA患者网织红细胞分析：在FSC/SSC二维图中设定红细胞门R1，血小板门R2。将阴性对照（绿色）与待测标本（红色）的FL1直方图重叠，设定界标（M1）,使阴性对照的非特异性荧光率小于0.3%。分析待测标本中的网织红细胞百分率为29.33%。,86,V 流式细胞仪的应用,应用举例（2）白细胞分类计数 原理：根据白细胞CD45、CD14抗原表达的差异，结合不同白细胞光散射的特点，用流式细胞仪进行多参数分析，可对白细胞中三类五种白细胞进行较准确的分类，尤其是对百分比较低的嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞计数较为适用。分析参数有：FSC、SSC、CD45（FL1）、CD14（FL2）等。分析图形有：CD45/SSC二维图、CD14/SSC二维图、FSC/SSC二维图、CD45/CD14二维图、CD45/CD14/SSC三维图等。,87,V 流式细胞仪的应用,白细胞分类计数正常人血液白细胞分类计数：CD45-FITC/CD14-PE 双染色。进行FSC、SSC、CD45、CD14四参数分析，可将白细胞分为三类五种。在二维图上，不同颜色代表不同细胞。计数15000个细胞，各种细胞百分率如下：L-32.8%、B-0.91%、M-6.54%、N-57.30、E-2.38%。,红色-淋巴细胞（L）黄色-嗜碱性粒细胞（B）天蓝-单核细胞（M）深蓝-中性粒细胞（N）品红-嗜酸性粒细胞（E）,88,V 流式细胞仪的应用,白细胞分类计数正常人血液白细胞分类计数：CD45-FITC/CD14-PE 双染色。以SSC、CD45、CD14三参数作三维图分析。在三维图上，不同颜色代表不同细胞。计数15000个细胞，各种细胞百分率如下：L-32.8%、B-0.91%、M-6.54%、N-57.30、E-2.38%。,红色-淋巴细胞（L）黄色-嗜碱性粒细胞（B）天蓝-单核细胞（M）深蓝-中性粒细胞（N）品红-嗜酸性粒细胞（E）,89,V 流式细胞仪的应用,白细胞分类计数慢粒患者血液白细胞分类计数：CD45-FITC/CD14-PE 双染色。在SSC/CD45二维图和SSC/CD45/CD14三维图上，不同细胞各自分布于不同的平面或空间。可见B、E、N增多（细胞密度分布增大），分别为：B-8.9%、E-6.22%、N-72.56%。,红色-L黄色-B天蓝-M深蓝-N品红-E,90,VI 流式细胞仪实例,目前，在临床检验领域内应用较为广泛的流式细胞仪主要是美国BD公司和美国Coulter公司生产的各型流式细胞仪。,91,VI 流式细胞仪实例,FACS Vantage 科研型流式细胞仪 仪器功能强大，可配置多种激光光源、进行多色荧光参数（可达5色以上）分析，并可进行细胞分选。可根据需要对仪器的设置进行灵活、方便的调节，能适应不同的科研目的。,92,VI 流式细胞仪实例,FACS Calibur 临床型流式细胞仪 仪器设计精巧，配置两种激光光源（488nm、635nm），可用于14色荧光分析，有细胞分选功能。该仪器操作简便，并配备了自动进样装置，可十分方便地进行大批量标本测试。,93,流 式 细 胞 仪,地址：武汉市武昌区紫阳路275号 湖北中医学院紫阳校区检验系邮编：430064电话：027-88073859 E-mail：,