第二章基因工程制药新版5.ppt

第三节 基因工程制药生产的基本过程,一、工具酶的分离纯化二、载体的分离纯化三、外源DNA和目的基因的分离和获得四、外源DNA与载体DNA的切割与连接五、宿主细胞的选择和基因导入操作六、基因工程菌的稳定性及生长代谢的特点七、基因工程菌中试八、基因工程菌的扩增和发酵生产九、基因工程药物的分离和纯化技术十、变性蛋白的复性十一、基因工程药物的质量控制十二、基因工程药物的制造实例,娠秆举那绝凸静葵牵奖河傀淌包资某鲜畅蒙拧刁芋凄敛瓮殊哈元露轩窃栗第二章基因工程制药新版5第二章基因工程制药新版5,六、基因工程菌的稳定性及生长代谢的特点,（一）基因工程菌质粒的不稳定性（二）质粒稳定性的分析方法（三）质粒不稳定的原因（四）提高质粒稳定性的方法（五）基因工程菌的生长速率（六）蛋白质产量/菌体数量比（七）能量供应与菌体生长的关系（八）小分子前体、催化剂供应与菌体生长的关系,劣馒辰掳每泵市粒纂费徐朱琵晒融镭慢垄秆惩淄各忠龙想甄仅驰沁开实朋第二章基因工程制药新版5第二章基因工程制药新版5,（一）基因工程菌质粒的不稳定性,基因工程菌在传代过程中常出现质粒不稳定的现象，有分裂不稳定和结构不稳定。由于质粒不稳定导致的质粒丢失菌与含有质粒的菌之间生产速率不一致导致可能的生长优势，进而能在培养基中逐渐取代含质粒菌成为优势菌群，从而减少基因表达的产率，导致基因工程菌在生产过程中出现不稳定现象。,铀赃鄙形湾募牵癣裴妙枢乖语烙谍嘘挚靶汝粤咨佰侩闭心泣湾付该未昂捐第二章基因工程制药新版5第二章基因工程制药新版5,（二）质粒稳定性的分析方法,（1）将工程菌培养液样品适当稀释，均匀涂于不含抗生素标记的平板培养基，培养10-12h，统计所长出的菌落数A；（2）然后随机挑选100个菌落，接种到含有抗生素标记的平板培养基，培养10-12h，统计所长出的菌落数B；（3）计算B/A的比值。该比值能反映质粒的稳定性,称为稳定性(stability,ST),藻焦傲胯檄汛授丢旭惕鲤捕挫桓搬姐锤踢妈仆阻焚印曝膏蜡刨涧双荡伯为第二章基因工程制药新版5第二章基因工程制药新版5,（三）质粒不稳定的原因,1、分裂不稳定:指基因工程菌在分裂的子代菌体中，出现一定比例不含质粒的现象。它主要与2个因素有关：（1）工程菌产生丢失质粒的概率，拷贝量低的工程细菌，它所产生不含质粒的细菌变异株和概率较大。（2）丢失质粒的细菌、含有质粒的工程菌之间的竞争力大小。2、结构不稳定:指外源基因从质粒上丢失、或者发生碱基重排、缺失现象，最终导致工程菌性能改变的现象。,犀慈韵嗓几馅仕将光崩徊缎暂卓嚷李博需赢虽泵壹绣蓝韦至慈汹仲墓募历第二章基因工程制药新版5第二章基因工程制药新版5,（四）提高质粒稳定性的方法,1、选择合适的宿主菌2、选择合适的载体3、选择性压力4、分阶段培养5、控制培养条件6、固定化,漾浦芍俯熬击津瞬圭谱咖誊撼薪缮告挣买讹浅畜届吊哗钥辫甜歧锅皇析磷第二章基因工程制药新版5第二章基因工程制药新版5,1、选择合适的宿主菌,宿主菌的遗传特性对质粒的稳定性影响很大。,丛浊款捌赌涡枉媚糟烤浪蔼戒啥女瘤凌俗责栓架攘肠翱流摩漠忿朋赤冯尧第二章基因工程制药新版5第二章基因工程制药新版5,2、选择合适的载体,含低拷贝质粒的菌产生不含质粒的子代菌频率大于含高拷贝质粒的菌。,震颤各篓翱伴燕盎私羡饶考扦播微友县糠抓逞率辈登叙异尊胺恐陵坎胰件第二章基因工程制药新版5第二章基因工程制药新版5,3、选择性压力,因为丢失质粒的细菌在含的抗生素的培养基中不能正常生长。所以可通过加入抗生素来抑制质粒丢失的细菌的生长。,料追魂惠负侗酱侗勾幅饼挠割洗述圣触洼勒譬睦随车狗却洲鼓痔咨菜砖谆第二章基因工程制药新版5第二章基因工程制药新版5,4、分阶段培养,工程菌的培养一般分为2个阶段：（1）第一阶段:先使菌体生长至一定密度。（2）第二阶段:开始诱导外源基因的表达。由于第一阶段外源基因没有表达，减少了丢失质粒的细菌的产生概率，也就增加了工程菌的稳定性。,全不卵梧嫂零奸慢窃翘筑戌郴竖墨橙灸袋耳潍良爱崭兜哀沂囊聚唤凡翼队第二章基因工程制药新版5第二章基因工程制药新版5,5、控制培养条件,通过温度、pH值、培养基组分、溶解氧的综合调节措施通过以下方法可以提高质粒的稳定性。（1）间歇送氧（2）改变稀释速率,注绝赏熊贤斑总叙凳丈罐灶毕笋呜管次调佣朴苟胜尼邵昧踩益涣匆盈消也第二章基因工程制药新版5第二章基因工程制药新版5,6、固定化,固定化可提高基因重组大肠杆菌的稳定性。,古判鹏挣尤贰最祭姚救棚文冯厦角突就鞋淡弛刊潘苹靖刚诲仁逝劝兼匙铺第二章基因工程制药新版5第二章基因工程制药新版5,（五）基因工程菌的生长速率,细菌菌体生长是核酸和蛋白质的综合表现，通常用比生长速率表征。比生长速率:表征微生物生长速率的参数。菌体生长对于提高质粒的稳定性、减少代谢副产物的积累、提高外源蛋白质的产量都有重要的意义。基因工程菌的生长速率可通过选用不同的碳源、控制补料量、稀释速率的方法来加以控制。,述裳渤蜂昼芭痪仰猎堕储索星命衙捻迁陷绅贰咀勿篮辰狡加领睫逛溯潭淤第二章基因工程制药新版5第二章基因工程制药新版5,（六）蛋白质产量/菌体数量比,在基因工程菌的发酵生产过程中，蛋白质产量/菌体数量比基本上是一个恒定值。细菌生长速度快，其蛋白质合成的速度也相应加快。,勾械挪鹤井涝诡恼汲扇颤块同厉队辑税鹊麦委典痘快榔腑叫峭殴肖萌温李第二章基因工程制药新版5第二章基因工程制药新版5,（七）能量供应与菌体生长的关系,1、Andersen 理论（1）Andersen等人通过实验发现，培养基中所能提供的最大能量决定着工程细菌的最大生长速率。（2）当培养基提供的能量不足时，细菌往往会产生代谢副产物乙酸，而乙酸则会明显抑制细菌的生长。其实质是由于三羧酸循环的供能不足，导致部分乙酰辅酶A转化成乙酸来供能。2、改进方法（1）适当提高pH值，可以减少乙酸的抑制作用。（2）分批选用不同的碳源、控制补料速度、能在一定范围之内，控制细菌的过度生长，从而抑制乙酸的产生。,押舀富词廖焕溪盔挞蹋胳诺闪咳坷块剂莲绽辐濒勃洞落收嚏膳趣洼买余勃第二章基因工程制药新版5第二章基因工程制药新版5,（八）前体供应与菌体生长的关系,1、工程菌的生长速率往往低于未经克隆的原始宿主细胞2、外源基因的大量表达常常引起工程菌的生长停滞。这种停滞与能量供应无关。3、在基础培养基中加入氨基酸，能使细菌的生长速率提高。4、当合成材料的前体物供应不足时，工程细菌就会产生“严紧反应”。当氨酰tRNA不足时，核糖体就会在密码子上停留，并合成ppGpp的魔点蛋白，这是一种调控因子，会导致RNA聚合酶在模板上移动的停顿。,匆彼使茁验捉退比余晤熔调唐考泳甭腰宗盯才评泽拷蓟趣状远梦揩凸逾醚第二章基因工程制药新版5第二章基因工程制药新版5,七、基因工程菌中试,中试:生物技术药物与其他药物一样，从实验室研究到产业化必须经过中间放大试验的系列工艺研究和验证，这种中间放大试验简称之。,中试放大的目的是验证、复审和完善实验室工艺所研究确定的反应条件，及研究选定的工业化生产设备结构、材质、安装和车间布置等，为正式生产提供数据，以及物质量和消耗等。,洼描屡跪赡夯谈徘倡损碱邻醚害魂捏亚垫延械檄窃殖袭蔷堕稗扶蛤葫党丘第二章基因工程制药新版5第二章基因工程制药新版5,药物从实验室的微量制备到工厂的产业化制备，并不是简单的数量级的线性放大关系，而是各种研究技术的系统集成和放大优化。中试研究的理想状况是工艺稳定，工艺规模同等条件放大，使设计的生产批量和成本符合使用要求。基因工程菌中试需考虑以下几方面：1 工程菌的选择2 反应器的设计3 发酵培养基的组成4 工艺最佳化与参数监测控制5 计算机应用,夷两搓钦煌膊刽杉酮蔓如也阜披后池喷素屯膘挖靡恰示裹袱疼公母瞅痕蝗第二章基因工程制药新版5第二章基因工程制药新版5,1 工程菌的选择,能用基因重组技术获得高产潜力以工业原料为培养基生产工艺能用一般的工业生产经验产生和分泌的蛋白质不致病、无毒性、能安全生产。代谢能控制,客上弗殴策哈毫瘸频图圣吟淖诚勘奴溅惮静床龙枝慷寻属激誉温儒周芝芋第二章基因工程制药新版5第二章基因工程制药新版5,2 反应器的设计,反应器（发酵罐）的设计应符合生物反应与化学工程需要，因此在设计前应取得5 种生物数据：培养细胞系特性细胞生长率发酵罐消毒方法温度、溶氧、二氧化碳、pH值、代谢产物后处理效果,船蚀肝涯吃忆岔偶枉严倚咐奸能肝鼓博蘸栖直谗章丹浑粪婴改摆岳由执囤第二章基因工程制药新版5第二章基因工程制药新版5,3 发酵培养基的组成,培养基作用:提供化学元素,如碳、氮、氧、氢、磷、微量元素 提供特殊的营养源，氨基酸、维生素 提供能源，如葡萄糖 控制代谢,嘉牲庸酮粥龙乞负缅劣浅垛晨径脱葛慰陛烤曾针灿咋饱帝址诬爆践釉有臼第二章基因工程制药新版5第二章基因工程制药新版5,4 工艺最佳化与参数监测控制,工艺最佳化：最快周期、最高产量、最好质量、最低消耗、最大安全、最周全的废物处理效果、最佳化速度与最低失败率的综合指标。参数监测控制：生物反应中，有4种参数需监测：主要参数：pH值、温度、溶氧、二氧化碳 生物量：浑浊度、细胞组分、总氮量及菌丝干重 碳源：糖、有机酸、乙醇、淀粉、脂质 产品,沦贩言颖行请篡危痪超汽超击剿烂鄙鳞怖异缸烷栏狈邹夫鹤婪蚁抹睁股嗡第二章基因工程制药新版5第二章基因工程制药新版5,5 计算机应用,热电耦测量-温度离子敏感电极-元素氧化还原电极-还原电位热量计-热平衡,全部数据存于计算机,茂鞠迫段逞倦蓬肠攒涸此俺沃嘘揖揪胞象酉甸涕悯舀轴尊渍兜荆蛋妄扰申第二章基因工程制药新版5第二章基因工程制药新版5,最终目标：工艺最佳化、产品产量与质量不断提高、原材料与能源消耗不断下降、成本降低。经计算机计算，模拟出一个高质、高产、低成本的生产工艺最佳化的控制微生物的数学公式。,鼎献贝啡孟牙脂洁拳消借峨辱弯伟毒碘晚幻申陶脆劲并学就青缕札旨滤世第二章基因工程制药新版5第二章基因工程制药新版5,八、基因工程菌的扩增和发酵生产,（一）基因工程菌培养的程序（二）基因工程菌的培养方式（三）影响基因工程菌培养的各种因素分析（四）基因工程菌的培养设备-发酵罐（五）基因工程菌发酵工艺的优化,揭坊垦扛谩硅饰霖体俞嗅趟估跃懒脊娱金虚删双自菱腿泼擎讫泡墟饱颧旬第二章基因工程制药新版5第二章基因工程制药新版5,（一）基因工程菌培养的程序,摇瓶操作：了解工程菌生长的基础条件，如温度、pH、培养基各种组分以及碳氮比，分析表达产物的合成、积累对受体细胞的影响；培养罐操作：确定培养参数和控制的方案和顺序。,塔音底硒匙邹坍庇俏韦沃琐广暴妥塑吼邮佯稽寝升纂者绦连柬楷机适裴秆第二章基因工程制药新版5第二章基因工程制药新版5,（二）基因工程菌的培养方式,1、补料分批培养2、连续培养3、透析培养4、固定化培养,勇榴贺嚏戈莲浙云文径抵妓妈刁佛瘤镰齿括垃锈砸竞坟备时箭烤秉肯溜泼第二章基因工程制药新版5第二章基因工程制药新版5,1、补料分批培养,将种子接入发酵反应器进行培养，经过一段时间后，间歇式或连续地补加新鲜培养基，使菌体进一步生长的方法。其目的是创造一个良好的微生物环境，延长菌体的对数生长期，来获得高密度的菌体总量。,疽熟群邹指郎呻吵普样陡韧完壬琐它嫡娥绕骤狐甫弃矢映蒸鬃藩猿差收唉第二章基因工程制药新版5第二章基因工程制药新版5,2、连续培养,将种子接入发酵反应器中，搅拌式培养达到一定的菌体浓度后，同时进行进料、出料操作，通过控制一定的营养物稀释比率，来进行不间断式培养的培养方式。连续培养利于保持生产环境的恒定，利于控制菌体的生长速率。但是由于基因工程菌的不稳定性，导致连续培养比较困难。,扑哗确前千顺庇噪绰盼诅忠晶杖疆斥织锚首赊辱鉴政材还叹耙查瞄淘急咽第二章基因工程制药新版5第二章基因工程制药新版5,3、透析培养,透析培养是利用膜的半透性原理，使得代谢产物和培养基分开，通过去除培养液中的代谢产物的方法来消除代谢产物对工程菌的不良影响。透析装置是用半透膜将发酵器隔成两半，形成发酵液区和透析液区，通过透析来及时移去合成产物。半透膜的种类、孔径、面积、发酵液和透析液的比例、透析液的组成、循环流速、培养持续时间等因素会影响产物得率。,座刽膘翟腕拥氓敲霸胆灵适充若舀旧镇柱伟酵蛋钱绅皇堵喷辩壮茧欣贩宿第二章基因工程制药新版5第二章基因工程制药新版5,4、固定化培养,为了维持质粒的稳定性，将固定化技术和基因工程菌结合起来，进行固定化式连续培养，有利于提高生产效率。,攀慧侈丘高栈芬隙敛滔刨勘溢升峻霍蛮却妻揭吾拍袖瓣自誉某带鲍瘟佰枚第二章基因工程制药新版5第二章基因工程制药新版5,（三）影响基因工程菌培养的各种因素,基因工程菌 传统微生物生物材料含外源重组基因 不含外源重组基因发酵工艺使外源基因高效表达 使自身基因表达目的产物 产生外源蛋白质 产生自身的代谢1、培养基的影响 4、溶解氧的影响2、接种量的影响 5、诱导时机的影响3、温度的影响 6、PH值的影响,睛懈载书殉万玻井惋祖醇竞燕端誉卯方足澡仪袁独路尧挖炔摄川擞婪链茵第二章基因工程制药新版5第二章基因工程制药新版5,1、培养基的影响,（1）常用碳源：葡萄糖、甘油、甘露糖、果糖。（2）常用氮源：酵母提取物、蛋白胨、酪蛋白水解物、玉米浆、硫酸铵、硝酸铵、氯化铵。（3）其它组份：无机盐、微量元素、维生素、生物素。（4）无机磷在许多初级代谢的酶促反应中是一个效应因子。,速书臂裹肿尹丹匈协袒烤奈拂裁桔肘菇神譬转枯弗旬者晚澜秘履巢谦岂攘第二章基因工程制药新版5第二章基因工程制药新版5,2、接种量的影响,接种量是指所移入的种子液体量与培养液体量的比例，它的大小会影响发酵物的产量和发酵周期。（1）接种量小，菌体生长延迟，不利于外源基因的表达。（2）接种量适中，生产菌能够迅速占领整个培养环境，减少菌体污染的机会。（3）接种量过大，菌体生长过快，代谢产物积累过多，反而会抑制后期菌体的生长。一般来说，10-15%的接种量，菌体的延迟期短、菌群迅速繁衍、很快进入对数生长期，适用于个源基因的表达。,缺惋窥卞第渝乘嗓峙梢膏皋迅文捏乓膀吝阔洪厢扼随卉旁挡俯爹支篆忿构第二章基因工程制药新版5第二章基因工程制药新版5,3、温度的影响,温度对基因表达的调控作用发生在复制、转录、翻译、小分子蛋白质的合成水平等方面。（1）在复制水平，温度可影响基因拷贝数量。（2）在转录水平，温度可影响RNA聚合酶的作用，而来调控基因表达。（3）在翻译水平上，还可以通过小分子蛋白质的合成水平来影响基因表达。（4）温度还影响蛋白质的活性和包含体的形成。,材潭褒瑞打脱目知汁漾吐鉴拖肆船黔迈芯宝日占猜桔凛呆乏泻匿碴囊缓汀第二章基因工程制药新版5第二章基因工程制药新版5,4、溶解氧的影响,溶解氧对于工程菌发酵过程中的菌体代谢是有十分重要作用。细菌在大量扩增过程中，要进行消耗氧气的生化反应过程。因此，维持较高水平的溶解氧水平（DO240%），才能维持工程菌的快速生长和繁衍。,采用调节搅拌转速的方法，可改善培养过程中的氧供给，提高活菌产量。,黑糙妮出幕八机谦播苟沼疾卡垢譬哼痞虫祈刺泄庞骇垃放赂毕叉或故里救第二章基因工程制药新版5第二章基因工程制药新版5,5、诱导时机的影响,对于PLclts875突变株工程菌来说，在28-30培养时，突变体能产生阻遏蛋白、来阻止启动子的转译。当温度升到42时，这种阻遏作用就消失。此时温度对于工程菌的表达起诱导作用。一般来说，对于处在生长期后期的工程菌进行诱导，如菌体细胞密度在109个/ml时，通过升温诱导，可达到蛋白质表达增产的效果。,奥臃茵殴臻类祖战诗卑散颧卓菱凄昌垣捧凡郝殉脊衬脱狰霞铣晓晚挂狂烁第二章基因工程制药新版5第二章基因工程制药新版5,6、pH值的影响,pH对于细胞的正常生长、外源蛋白的高效表达都有影响。（1）细胞生长期的最佳pH范围是6.8-7.4。（2）外源蛋白表达的最佳pH范围是6.0-6.5。在发酵过程中，细菌自身对pH值有一定的调节能力。当pH值超出其调节能力的范围时，会影响细菌生长。发酵前期，pH值可控制在7.0，随着蛋白质的表达，pH值不断下降，当pH6.0时，应及时开动碱泵，加入碱液。,躺象海赐意妓搪鬃萨屋予搞揭赌斟筑魔泡锐忽薪俩永荒衍仗偿菌恭配益努第二章基因工程制药新版5第二章基因工程制药新版5,（四）基因工程菌的培养设备-发酵罐,1、发酵罐的组成2、发酵罐的要求,涂哲辛版署胸浆选闺凭邢犹特烙加波辖驹窟莆炔瞎歌全褂莽返挤镣缘酝连第二章基因工程制药新版5第二章基因工程制药新版5,1、发酵罐的组成,（1）空气加入系统-去水去油的空气压缩机+气体流量计+空气无菌过滤器+溶解氧电极+溶解氧控制系统。（2）pH调节系统-H电极+pH控制系统+酸碱补加装置。（3）温度控制系统-热敏电极+温度控制系统+加热器+冷冻水浴冷却系统。（4）消沫装置（5）取样装置（6）旋转搅拌装置（7）进料系统-培养基加入口。（8）排出系统-气体排出+冷却水排出+废料排出。,湘校位戎恭僳誊果志婚昌诱撰傣土飘芜挛召禁憎熏拟澎果官忿察压陛躲洋第二章基因工程制药新版5第二章基因工程制药新版5,2、发酵罐的要求,（1）总体要求（2）具体要求,恼窑惰澳掷噎甸奔蔷岁贷知青舌柒系雏塞行晌镇娠轩骚告拆堡斡情料戳泻第二章基因工程制药新版5第二章基因工程制药新版5,（1）总体要求,（A）保证发酵环境条件恒定，（B）不影响其遗传特性，（C）不能引起所带质粒丢失。,跑辈定茅顺曳棘贿爸骂生伐法骏伯矩裁槐犹援蝴讹酚柑瞄抡育蓉窿专躺霸第二章基因工程制药新版5第二章基因工程制药新版5,（2）具体要求,（A）提供菌体生长的最适条件，（B）培养过程不得污染，（C）保证纯菌培养，（D）培养及消毒过程中不得游离出异物，（E）不能干扰细菌的代谢活动。（F）发酵罐应当用不锈钢制成，表面光洁，没有灭菌死角。（G）任何接口必须用密封圈，不得存在泄漏，（H）为避免基因工程菌在自然界扩散，培养液废物必须经过杀灭处理后才能进行排放。以免基因污染。,压氟熏握删凄下肄姻萍熟台吴汪嘛溜遮傍竞陕蚌灾砾效盗龟义樱篇翻矿稠第二章基因工程制药新版5第二章基因工程制药新版5,（五）基因工程菌发酵工艺的优化,是指形成基因工程菌发酵生产的最佳化工艺，（1）目标-最快反应周期、最高产量、最高质量、最低消耗、最大安全性、最周全的废物处理效果、最佳速度、最低失败率。（2）具体方法-通过在不同菌种之间进行重复试验、绘制出发酵代谢曲线、从而设计出最佳工艺条件。,义捅绝蛔淮昏原薯舆同绒壮忘竟诚撰些酸杠檀陛妮莲瓷僚广迭傅窝聊皮碾第二章基因工程制药新版5第二章基因工程制药新版5,