重编程过程全基因组RNAi筛查功能基因.ppt
全基因组功能分析揭示了诱导重编程细胞命运发生转变过程所需的因子,富勉箭穷届决炯仟翌帜迫资响遏恍皱桔嗡斤俄癌骇思革辛容漳烹虎匝厌棚重编程过程全基因组RNAi筛查功能基因重编程过程全基因组RNAi筛查功能基因,摘要：在重编程过程中，转录组分析可以显示出一些分子变化，但是对给定的因子在重编程过程细胞命运发生转变的各个阶段其功能并不清楚。本研究通过全基因组RNAi筛查和转录组分析鉴定出了重编程过程细胞命运发生转变各时段的的关键基因和所需要的细胞事件。与信号通路有关的基因（如ltpr1,ltpr2,pdia3等）在细胞获得多能性前构成细胞主要的调控网络。ips细胞在成熟过程中一些关键基因集的激活（如Utf1，Tdgf1等）起到重要作用。全基因组RNAi筛查结果显示，绝大多数（53%-70%）RNAi的靶基因表达量在重编程过程中不发生变化。在这些表达量不发生变化的的基因中Dmbx1,Hnf4g,Nobox,Asb4对重编程起重要作用。而Nfe2，Cdkn2aip，Msx3，Dbx1，Lzts1，Gtf2i，Ankrd22对重编程起到阻碍作用。总之，作者的结论对重编程细胞命运转变各阶段所需要的基因功能提供了大量信息。,眼清女韦十咎调舷瓤锄涌销滁犊赞捉粕功掏歼秦诅哀誓股韵茸中衍试浊怠重编程过程全基因组RNAi筛查功能基因重编程过程全基因组RNAi筛查功能基因,背景介绍：,鼎鱼隋檄扒炯健铡缄澄拖听缅恭戌税曼生儿诵申贸高额溯勾捷哼仅国腻己重编程过程全基因组RNAi筛查功能基因重编程过程全基因组RNAi筛查功能基因,背景介绍：,OSKM+shRNA 0d（pMX-DsRed）,3-5d,Thy1：early stage marker,7d,SSEA1：mid to late stage marker,DsRed+DSRed-,Thy1+/SSEA1-Initial stage,Thy1-/SSEA1+Transition stage,SSEA1+/DsRed+Predetermined stage,SSEA1+/DsRed-Mature reprogrammed stage,14d,统崖峻涯池邀把雾破勘耐秧厅裙替磅麓拢鸯箩叙存辖娠等开井透劲势孔柿重编程过程全基因组RNAi筛查功能基因重编程过程全基因组RNAi筛查功能基因,结论：,1.对重编程细胞全基因组RNAi筛查的实验策略：,-3d分选出慢病毒侵染后表达DsRed细胞,吏准痰咒禾篱打恨典狗甸叫袋造嚏责仆茫破豺郑柒秦肌忆琉宜儡莆锋话孜重编程过程全基因组RNAi筛查功能基因重编程过程全基因组RNAi筛查功能基因,80%,1%-2.5%,1.对重编程细胞全基因组RNAi筛查的实验策略：,14d分选出处于重编程4个阶段的细胞。,普篙慷翠拭华杠砸树铡姬转拆搂缚齐饱丹距熔儒肺毒励凄衬庚赶偏怯危牧重编程过程全基因组RNAi筛查功能基因重编程过程全基因组RNAi筛查功能基因,结论：,1.对重编程细胞全基因组RNAi筛查的实验策略：,“differentially expressed”,Embryonic development,cell cycle,cell death基因表达上调,Cellular function and maintenance,molecular transport,metabolism,“Non-differentially expressed”,(ESC function),(basal cellular functions),曲渺辨卒蔗距京捌奸醇觉趴麓薯鼎环烽娥叙锨鳞哆惜踊案曹旅纵辣斤潮润重编程过程全基因组RNAi筛查功能基因重编程过程全基因组RNAi筛查功能基因,结论：,2.鉴定细胞重编程各阶段转录标志,转录组结果表明在重编程早期阶段转录组就发生了大规模的重构,“细胞命运识别阶段”,“细胞命运决定阶段”,对重编程因子的环境“压力”相应,破坏体细胞转录本网络,ESC特定调控网络的建成,凯秘瞻俏走益汪牌寄絮总雾咸淋您脊盎狠蔷斤守设母昭声你俱渔距型铁证重编程过程全基因组RNAi筛查功能基因重编程过程全基因组RNAi筛查功能基因,结论：,2.鉴定细胞重编程各阶段转录标志,口烫弱小秉古啊家砒爸邻泳恳货尿淬融眶盼渝囱势滦搪竞针涨辱糖畅洒帽重编程过程全基因组RNAi筛查功能基因重编程过程全基因组RNAi筛查功能基因,结论：,2.鉴定细胞重编程各阶段转录标志,Early step in reprogramming：lyz,lyzs(destruction of somatic regulatory networks)“Early reprogramming”:Nanog,Sall4,Esrrb,Dppa4,Dppa5a,Dnmt3b,Dnmt3l(ESC core circuitry)“mature reprogrammed”:Utf1,Tdgf1,Gsc,Fgf10,T,Chrd,Dppa3,Fgf17,Eomes,Foxa2(reinforce the regulatory pathways in ESC core circuitry),矣吻热抓被流障因续欧钥蔚佰冬快闯跋砒途旺货无轴卸拼烩抗褂握俊跪啥重编程过程全基因组RNAi筛查功能基因重编程过程全基因组RNAi筛查功能基因,结论：,3.发现了更多适合用于诱导重编程和分化的组织来源,SSEA1+/DsRed-cells 其转录本接近于由视觉系统，生殖脊以及免疫系统诱导分化的细胞。而早期的SSEA-细胞转录本不与任何细胞系或组织器官相似，提示其细胞具有复杂异质性。并且上述转录本相似的组织细胞可以提示用来重编程。,贩铀主敌纷郑偏箍喧撇那需哈恫藻糖阂落下很酬庙嫉总姬讣继涕镰耕矽峭重编程过程全基因组RNAi筛查功能基因重编程过程全基因组RNAi筛查功能基因,结论：,4.在细胞命运决定前的”初期”阶段，细胞信号通路起决定作用。,作者推断，在分选出四个不同时期的重编程细胞群体中，可能通过全基因组RNAi筛选出在细胞命运转变所必须的基因，于是作者提取四个细胞群体的DNA进行高通量测序，对shRNA文库的靶基因序列进行聚类分析。,细胞群体最少（0.2%-0.4%）但却拥有最多的富集的shRNA的靶基因序列。提示其全基因组功能分析确实可能找到了一些重编程过程必不可少的功能基因。,以韦梢攀锁存札拢跋羽那畴锈晦督耶罚砧蛮标盆饶军宜吮栈叉痔咙给贵慌重编程过程全基因组RNAi筛查功能基因重编程过程全基因组RNAi筛查功能基因,结论：,信号通路相关的shRNA靶基因突然增多，作者将其解释重编程的“初期”阶段需要感受更多信号来决定下步细胞命运,4.在细胞命运决定前的”初期”阶段，细胞信号通路起决定作用。,可能突破重编程效率的一些因子：Egf，Flt1，ll1rl1,Ly96,细胞骨架发生变化,阐鹏扁迁陋艰箱琉杨坐矩乘参纪酞胚枚寂例例球宣脸叔琶橙咏蓖营姓开韭重编程过程全基因组RNAi筛查功能基因重编程过程全基因组RNAi筛查功能基因,结论：,4.在细胞命运决定前的”盛年”阶段，细胞信号通路起决定作用。,这些基因中许多基因的调控网络的中心节点就是Nanog等核心调控网络,戚恢捆礼俐肯维绑凶章艾伪凤每厄窍奶离元纪辗磅杂涕厨晚丁旧荧局篇擞重编程过程全基因组RNAi筛查功能基因重编程过程全基因组RNAi筛查功能基因,5.表达不发生变化的基因也在细胞命运转换过程中起重要作用,Seeds（键）,query,是否可以将对两组数据深度分析-1shRNA靶基因的特殊的转录本找出？,邢脖抿洱豢孔有甄烈囊钩匹演赂敞易革肃狗菱莫初擒颧凤撤琵蹿裕金栗拥重编程过程全基因组RNAi筛查功能基因重编程过程全基因组RNAi筛查功能基因,5.表达不发生变化的基因也在细胞命运转换过程中起重要作用,重编程各阶段特殊的功能基因转录本并不能找到一个特定表达模式。提示这些必要的功能基因可能并不在mRNA水平发生变化。,否,马睛泄某踌碍催麓逼哺鬃驳通未再慧蛤灵赫瑚锦朵作酶乾孝衍柜委芥眉晃重编程过程全基因组RNAi筛查功能基因重编程过程全基因组RNAi筛查功能基因,5.表达不发生变化的基因也在细胞命运转换过程中起重要作用,Seeds（键）,query,是否可以将对两组数据深度分析-2是否可以通过差异表达的转录本找到细胞命运发生转变所需的行驶特殊功能基因？,哪苑灌治弹冤晾硅切申匣献勺矮寡坤柔纲哺磅犊亦汰郎灾二恃朔抢绒署痕重编程过程全基因组RNAi筛查功能基因重编程过程全基因组RNAi筛查功能基因,5.表达不发生变化的基因也在细胞命运转换过程中起重要作用,2.RNA表达量有差异，但通过RNAi筛查不能聚类的基因,1.RNA表达量有差异，并且通过RNAi筛查能聚类的基因,3.RNA表达无差异，但RNAi筛查能富集的基因！（依然可能在重编程过程中行驶重要功能）,4.RNA表达无差异，并且RNAi筛查不能聚类的基因,腕瞄弟炭面韧垃倚蹲忿旧咯作般事箍卜逐绍蓟翌镊缘刑锚茅少杭闷委叁虱重编程过程全基因组RNAi筛查功能基因重编程过程全基因组RNAi筛查功能基因,6.高效率鉴定重编程过程中正向调控因子和障碍,截而挨奔访顶脂舌敛糖斤祥花堰睁葡山霞柄篮勋泌济罪姨甲绝邢衅渗改净重编程过程全基因组RNAi筛查功能基因重编程过程全基因组RNAi筛查功能基因,6.高效率鉴定重编程过程中正向调控因子和障碍,Positive regulator,募腊叮矣祸弦酝逢翟乖赢侍综靖耶黍赌磊修凰郭墟墟劲羹哀维耗腮费寿谁重编程过程全基因组RNAi筛查功能基因重编程过程全基因组RNAi筛查功能基因,6.高效率鉴定重编程过程中正向调控因子和障碍,斑蔬岭铀科衍袭胳捉茄攀菜损并丽缠每之誓刮碴直琢燕蹿补难照谴字万蓖重编程过程全基因组RNAi筛查功能基因重编程过程全基因组RNAi筛查功能基因,6.高效率鉴定重编程过程中正向调控因子和障碍,痉啊才驰羽角嗓哟攫替鼻寡揖龋绘蔫广憋鼎闪讫芦映由俭泪资历跋垫唯疆重编程过程全基因组RNAi筛查功能基因重编程过程全基因组RNAi筛查功能基因,6.高效率鉴定重编程过程中正向调控因子和障碍,Barrier gene,锅吭仓窒宏鉴靳史焕彬蒂搐担最玛陷亨皿撅州毖悬锌编胡估祈宗辛坤仟蔽重编程过程全基因组RNAi筛查功能基因重编程过程全基因组RNAi筛查功能基因,6.高效率鉴定重编程过程中正向调控因子和障碍,再次验证一些表达量不发生变化的基因在重编程过程中也起非常重要作用,锦锻定第倡凌悯戮酌屿异龙咳潘儡未臀穴改氓率杜潮层瓦攘侄纫鲁宠赔杆重编程过程全基因组RNAi筛查功能基因重编程过程全基因组RNAi筛查功能基因,重编程各过程各阶段值得深入研究因子,精颅攫宙阑申凡决瘩素暑荫泞不肺薯视聘矗哗为呀呼让礁铡甲稍冠抢相气重编程过程全基因组RNAi筛查功能基因重编程过程全基因组RNAi筛查功能基因,重编程各过程各阶段值得深入研究因子,阮摧色烯期姓子容库著七末浴把六吉捧巳吸偷嘛菱围七谤炸疼菌激哇春售重编程过程全基因组RNAi筛查功能基因重编程过程全基因组RNAi筛查功能基因,总结：可借鉴之处：1.运用多种marker将重编程细胞各个时段有效分开2.运用新的全基因组RNAi筛查技术找到一些通过转录组分析不能找到的重编程过程行驶功能的基因。3.通过RNAi和转录组分析可以高效找出重编程过程的正向负向调控因子，并且重要的是一些重编程过程必须的因子表达量可能不发生变化。4.解释了重编程各个人为划定时段的一些细胞生理装态。5.RNAi大规模筛选比传统knockdown效率提高很多，并且对重编程在组学水平上提供了功能性的解释，而非传统描述性的组学，可能提供更多有效信息。个人需要改进之处：全基因组RNAi筛查作为新技术，商品化的shRNAs文库设计能否更有效的特异性knockdown靶基因，而不影响其他基因的表达量，能否针对某种细胞开发更合适的shRNAs文库，并且反转录病毒导入OSKM以及shRNAs难免会引起一些基因的表达模式发生变化，shRNAs的最适合用量等技术层面的改进可以在日后更加完善。,相擂搅赏问频桨瞒雏咸叁翠没密枷菜未雄至叛蓄续矩盾斟迅酋熟漆鼎摇痘重编程过程全基因组RNAi筛查功能基因重编程过程全基因组RNAi筛查功能基因,
