毛细管电泳原理.ppt

第二章 毛细管胶束电动色谱,电解质中加入表面活性剂(surfactant，例如SDS)，使之形成胶束（Micelle），样品根据其疏水性(Hydrophobicity)强弱的差异，在胶束与电解质的分配系数有所不同來进行分离，样品疏水性愈強，则进入胶束的机会愈大。通常物质进入胶束后，泳动的速度会变慢，因此疏水性愈強的物质则愈慢出來。,毛细管胶束电动色谱原理,Micellar Electrokinetic Chromatography(MEKC),七种青霉素的分离,CZE:20mM Pi-Borate,pH 8.5,(B)MEKC:0.1 M SDS in(A)soln.,胶束电动色谱的特点,优点增加对弱极性物质分离的分离度在中药分析、天然产物分析、农药分析中经常使用,缺点稳定性不佳，达到好的重复性比较困难,第三章 毛细管凝胶电泳,毛細管內先填充凝胶(例如polyacrylamide或cellulose)，此时凝胶会在毛細管內形成分子筛，样品依分子量的大小在毛細管內移动速度不同而进行分离。主要用于核酸片断及蛋白分子量分析,毛细管凝胶电泳,CE双链及单链核酸分析,45-寡核苷酸质控,CE-SDS蛋白分子量分析,第四章 毛细管等电聚焦,第五章 亲和毛细管电泳-分离条件基于CZE,当在CZE样品或缓冲液中引入抗原或抗体时，便可以用于研究和分析抗体或抗原，也可以利用这种方法对电泳峰进行特异性定性。显然除抗原与抗体的选择需要应用生化知识外，其他方面的选择与CZE等相同。用于研究分子间相互作用测定，分子构型变化特定物质检测活性物质筛选,ACE测定分子间结合常数与解离速率,JAK2与SH2-B之间的相互作用研究,CE药物筛选,ACE用于相互作用筛选,适体Aptamer类似于抗体，但可以体外合成，结合常数比抗体更高，有广泛的药物筛选和临床诊断应用潜力 目前已有以下的一些蛋白的aptamer是采用CE方法筛选得到的IgEHIV type 1 reverse transcriptaseThrombinAnti-thrombin IIITaq DNA polymerase,ACE用于相互作用筛选,传统筛选方法如亲和色谱或者CEC筛选一个Aptamer需要4-6周而CE只需要几天就可以了，大大提高了筛选速度-MicroScale Bioseparations 2006,第六章 检测器选择,小分子检测大分子检测,CE检测器种类及性能,小分子检测,有紫外吸收首先选择二极管阵列检测器或紫外检测器无紫外吸收可以衍生化的，可以采用自外衍生的方法再用紫外检测器检测，如氨基酸、还原性糖等不可以衍生化的，可采用间接紫外法用紫外检测器检测，也可以尝试电化学检测器有荧光或需要高灵敏度检测的可采用LIF检测器需要测定结构或者难以用光学检测器检测的，可以考虑质谱检测,大分子检测,蛋白、核酸可以首先选择紫外检测器如果需要高灵敏度检测可以采用柱前或者柱上衍生的方法标记荧光，然后用LIF检测如果需要特异性检测，可使用特异性荧光探针，标记后再LIF检测需要测定分子量或氨基酸序列，可采用质谱检测多糖含量较高的多糖可以采用末端吸收法以紫外检测器检测含量较低的还原性多糖可用衍生试剂标记后以LIF、UV的方式检测,第七章 分离条件选择流程,分离条件的选择是毛细管电泳中最重要但也是最难之处。不同的专业研究工作者可能会有各自不同的选择策略和流程，我们提出如下九步选择流程，仅供参考：第一步，尽可能多地了解分离样品的类型、来源、组成及其性质；第二步，根据样品的可能性质和来源，选择分离模式，若无样品信息可先选CZE；,条件选择流程,第三步，根据样品性质确定检测方法，一般先选直接紫外吸收；第四步，确定样品处理方式，包括衍生方案以及离心过滤除蛋白等；第五步，根据样品解离常数计算最佳pH，或利用75mID毛细管和磷酸缓冲体系确定pH范围;,条件选择流程,第六步，根据所需pH构建缓冲体系，包括进一步优化pH、缓冲试剂浓度等；第七步，优化其他操作参数，如毛细管尺寸、分离电压和温度等；第八步，确定是否需要使用添加剂和使用非水溶剂；第九步，确定是否需要换用其他分离模式。,