植物组织石蜡切片的制作.ppt
植物组织石蜡切片的制作,一、实验目的1熟练掌握石蜡切片的方法。2掌握永久制片的制作过程，为研究植物的内部结构奠定基础。3学会植物内部结构的比较研究方法。,二、实验器具与试剂1器具石蜡切片机、烘箱、显微镜、染色缸、小培养皿、镊子、毛笔、吸水纸、纱布、载玻片、盖玻片等。2试剂10%番红水溶液、0.5%固绿（用95%的酒精配制）、酒精（100%、95%、80%、70%、50%）、二甲苯、蒸馏水、甘油、中性树胶等。,三、实验材料幼嫩植物各部分，根据季节选择材料。,四、实验内容与方法石蜡切片法是显微技术上最重要、最常用的一种方法。它是把材料封埋在石蜡里面，用旋转切片机切片，可以切出很薄的切片。凡是精细的工结构，大都用石蜡切片。全都过程如下：,1固定 2洗涤 3脱水与硬化 4脱酒精 2封埋 6切片 7粘片 8脱蜡 9染色 10脱水 11.透明 12胶封,实验二 1、石蜡切片技术固定、染色,一、实验目的：掌握制作石蜡切片中固定、染色、返蓝的基本操作技术,二、实验原理：石蜡切片法：是用石蜡浸透到组织中，并包埋组织，然后用旋转切片机将蜡块切成切片。只是切片中最常用的一种方法。,三、实验用品：1实验材料：瓜叶菊叶柄，长寿花幼茎。2实验试剂：卡诺固定液、FAA固定液、35%酒精、50%酒精、70%酒精、83%酒精、95%酒精、100%酒精、二甲苯、中性树胶、2%氨水、爱氏苏木精染液。3实验器具：解剖器，双面刀片，青霉素小瓶。,四、实验步骤：1取材：依据生物组织取材的各项注意事项。2固定：卡诺固定液、FAA固定液固定24小时。3复水：卡诺固定液（1h）50%酒精（1h）爱氏苏木精染液 FAA固定液爱氏苏木精染液,4染色（整染）：爱氏苏木精染液染色，染色时间视材料不同而有所不同，总之使材料最后染指红棕色为止，且内外均染色均匀。对于染不好的材料，可加长染色时间，还可通过负压，超声波加注浸剂等方法提高染色效率。时间为1-2天。,5返蓝：染好的材料，用自来水冲洗，加2%氨水使材料变为蓝色，时间也因材料的不同而有所不同，好返蓝的材料用水一洗就蓝。,附：分染：番红与固绿色法番红用l的水溶液，固绿用0.5的酒精液(用95的酒精配制)，染色步骤如下：,讨论和注意点：(1)用番红和固绿这个组合染成的切片，木化、栓化和角质的细胞壁，被番红染成鲜红色，纤维素的细胞璧，被固绿成绿色。就维管束来讲，木质部染红，韧皮部染绿，区别极清楚。(2)在50酒精中脱色，需经实践，如脱色不够，绿色难得染好，脱色太过分，做出来的切片，红色太淡，甚至于全是绿色，失掉了二色染法的用意。,实验二 2、石蜡切片技术脱水、透明、浸蜡、包埋,一、实验目的：掌握制作石蜡切片中脱水、透明、浸蜡、包埋的基本操作技术。,二、实验用品：1实验试剂：35%酒精、50%酒精、70%酒精、83%酒精、95%酒精、100%酒精、二甲苯、石蜡。2实验器具：电光纸、电热恒温箱、烤片机、解剖器、盆。,三、实验步骤：1脱水：35%酒精50%酒精70%酒精83%酒精95%酒精100%酒精100%酒精。每级1-2h。70%酒精处可长期保存。2透明：1/2二甲苯+1/2100%酒精(1-2h)纯二甲苯(1h)纯二甲苯(1h)3浸蜡：石蜡先置于60的温箱中，倒入含二甲苯及材料的小瓶中置于38温箱中，放置2-4小时。,4包埋：先提升恒温箱的温度至60，换纯蜡3次，每次1-2h，用硬的电光纸、牛皮纸叠纸盒，置于45-60的烫板上，倒入材料，摆放好材料，把标签（正面向外置于底部），补足石蜡，倒好后轻轻的置于冷水盆中，注意底面要接触盆中凉水，待石蜡全部凝固后可取出晾干，也可在凉水盆中放置过夜。,实验二 3、石蜡切片技术切片、粘片、脱蜡、透明、封藏,一、实验目的：掌握制作石蜡切片中切片、粘片、脱蜡、透明、封藏的基本操作技术。二、实验用品：1实验试剂：95%酒精、100%酒精、二甲苯、蒸馏水、加拿大树胶。2实验器具：切片机、烤片机、解剖器、载玻片、盖玻片、酒精灯、木筷、染色缸。,三、实验步骤：1修块、粘块、整修的步骤：选取所要切片的材料，从包埋的石蜡块上用单面刀片切割下来，注意不可损伤包埋的组织。确定切面的方位，用刀片将石蜡块的四面作初步的整修。保证材料四周都有石蜡包围。但不可太多。切面的上、下边平行。,点燃酒精灯，并准备一把旧的解剖刀。左手大拇指与食指间持整修好的石蜡块，材料向上用其余三指夹住台木。此时将解剖刀在酒精灯上加温后，即放在台木与石蜡块之间，因解剖刀已加温，遇上两面的石蜡都会融化，可立即将解剖刀抽出，石蜡块迅速压在台木上。,再将解剖刀蘸取少许石蜡碎屑，放在刚才固定的石蜡四周。此时，解剖刀再加温，并迅速将石蜡块四周的碎屑烫平。使石蜡块牢固地粘在台木上。修石蜡块上下面平行，是切成的蜡带呈一直线，不弯曲。每个切片中组织的距离接近。,2切片的方法：准备下列用具：毛笔、黑色亮光纸将已固着和整修好的石蜡块和台木装在切片机的夹物部分.,安装切片刀，将刀片夹在刀夹上，并调整好刀的角度。刀的斜度，非常重要，最好先切除的蜡块试刀，以确定刀的斜度，一经调度适合后，就不要随便变动，以免每次试刀的麻烦。移动刀片固定器，使夹刀部与夹物部之间的距离调整好，以石蜡块的表面刚贴近刀口为度，在旋紧切片固定器的螺旋。,调整石蜡块与刀口之间的角度与位置。修整蜡块，将刀片移近蜡块，使小蜡块的下边与刀锋平行，如不平行，可调夹物部上的螺旋。然后把它固定，再转下蜡块呈矩形才行。只有平整的蜡块，才能切出平整的蜡带。最后根据需要，调整控制切片厚度的机制。调度后，把它固定下来。上述四步骤完成后，就可进行切片，,开始切片。右手握旋转轮的手柄，摇动一转就可切下一片，切下的蜡片粘在刀口上，待第二片切下时粘在一起，所以连续摇动就可将切下的蜡片连成一条蜡带。这时左手就可持毛笔将蜡带提起，边摇边移动蜡带。转速为每分钟40-50为宜。,切成的蜡带到20-30厘米时，即以右手用另一只毛笔轻轻将蜡带挑起，平放在黑电光纸上。靠刀的一面较光滑，应向下，较皱的一面向上。切下的蜡片是否良好，此时应先行检查。切片工作结束后，仍将刀片用具擦拭干净。,3贴片：贴附牢固，在染色时不易脱落；是皱褶的蜡片伸展平整。用具：载玻片、粘片剂、解剖刀、蒸馏水、展片机及铐片机。,材料切成薄片后，须将切片粘在玻璃片上，加热展开，这叫粘片。所用载玻片必须清洁才能使用。粘片时，需把胶液(或称粘贴剂)置簿玻片上，再取切片，浮置胶液上，然后置烘片台上，使切片展开烫平，材料不现皱纹为度。最后将切片依次排好，用滤纸吸去多余水分，同时以记号笔在玻片上编号，放入温箱中烘干，温度3040约1小时即干。常用的胶液有下列三种：,(1)明胶液：这是粘片最常用的胶液，简便优良，配法是100毫升纯水中，加明胶4毫克，加热熔化，过滤即得。(2)梅氏蛋白质：鸡蛋清 50ml甘 油 50m1 水杨酸纳 1g用蛋白与甘油搅拌，同时加入水杨酸纳，调匀过滤，应用时以滤液15滴，放入纯水50毫升中即得。(3)Land氏液：阿拉伯胶 1克重铬酸钾 0.2克纯 水 100毫升,方法,将展片机温度调整到35，保持恒定。在载玻片上涂蛋白甘油粘片剂。其法是用细玻璃棒蘸取一小滴粘片剂，加在载玻片的中央，然后用洗净的手指（无名指）加以涂抹，范围不要太广，也不要太多，以能贴足够的蜡片为度。蛋白甘油粘片剂的配方：（不适宜用作蛋白观察）,将涂粘片剂的载玻片放在展片机上，滴加蒸馏水数滴，此时若发现水不均匀分散而聚成滴状，即表示玻片不清洁，有残留油脂等物在上面。用解剖刀将蜡带切成小段，每段的长度应以盖玻片的长度为准，一般应比盖玻片短约1/5-2/5。分片应从蜡带交界处分。,将蜡带轻轻移到涂有水的载玻片上，蜡片光面应向下贴在载玻片上，依次排列整齐。留出右端贴标签处。材料展平后，从展片机上取下，稍稍倾斜留出多余的水分，用吸水纸吸干背面及周围多余水分，放于烤片机（35）上烤干水分。,4.脱蜡：玻片烘干后，须将蜡脱去，才能染色，脱蜡用二甲苯，把烤好的载玻片放于盛二甲苯的染缸中纯二甲苯(5-10min)纯二甲苯(5-10min),若分染需再经酒精入水中，而后染色，其顺序如下：二甲苯1/2 二甲苯十1/2纯酒精100%酒精95酒精85酒精70酒精50酒精30酒精水染色以上各级约需510分钟。5.滴加加拿大树胶封藏。6镜检：,石蜡切片的异常及处理,一张理想佳良的切片，除组织固定适当和染色清晰之外，还应具备：薄、平整，无皱褶压缩，无裂损抓迹及擦痕，同时贴片排列密集，整齐位置适当，透明度好，封片用胶适量，盖玻片端正，无气泡等。,石蜡切片中的异常及原因和处理方法,注：切制石蜡切片遇到障碍大多数是：（1）刀钝或刀刃受损。（2）蜡块或切片刀的调整螺旋或是紧固螺旋拧不紧。因此，有经验的切片者在开始切制切片之前应习惯地反复核查（1）（2）这两点。,
