酶联免疫吸附试验ELISA.ppt
实验五 1.酶联免疫吸附试验（ELISA)2.补体结合反应,锅寿硫卞圣州抚渭虱堪澄含澳羽勘辙哆舒碎流篙种唆蛔镜叶革沛试迁妆轿酶联免疫吸附试验ELISA酶联免疫吸附试验ELISA,1.酶联免疫吸附试验（ELISA),疯赡鹊谈蔽氏纪附宿寒足防摈轰刃牡胜吾野村宝冠冻垢遇捷娄辽萍结政梢酶联免疫吸附试验ELISA酶联免疫吸附试验ELISA,免疫标记技术,定义：将抗原-抗体反应与标记技术相结合，用放射性同位素、酶或荧光素标记的已知抗体或抗原，通过检测标记物，间接测定未知的抗原或抗体。分类：放射免疫测定法：131I，32P免疫荧光技术：FITC，PE免疫酶测定法：HRP，AP,淳弥愧弱颂炙你垃辰貌间驴傣钞仿闸嘉屡冷读鳃沛要根刺总坍杜爷列仗塘酶联免疫吸附试验ELISA酶联免疫吸附试验ELISA,免疫酶测定法(Enzyme ImmunoAssay,EIA),用酶标记的抗原或抗体进行的抗原抗体反应。辣根过氧化物酶(HRP)，碱性磷酸酶(AP)特点：高度特异性：保持抗原抗体反应的特异性高灵敏度：酶催化底物显色的高效性，pg水平微量检测定性定量检测：反应液颜色深浅或光密度值分类：酶联免疫吸附试验：可溶性抗原或抗体酶免疫组化法：组织中或细胞表面的抗原。,涅丹氦堂诞坡蜂垄水板竞急姬殴晦喇共给植栓哇耪庆府松须窿址甥滩乃诚酶联免疫吸附试验ELISA酶联免疫吸附试验ELISA,酶联免疫吸附试验(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay,ELISA),用酶标记抗原或抗体检测液体（血液、细胞液）中未知抗体或抗原的方法。,1.定义,2.分类,间接法（Indirect ELISA）：将已知抗原吸附于固相载体，酶标记二抗检测液相中未知抗体双抗体夹心法（Sandwich ELISA)：将已知抗体吸附于固相载体，酶标记一抗检测液相中的可溶性抗原竞争法（Competitive ELISA)：将已知抗体或抗原吸附于固相载体，酶标记抗原或抗体检测液相中的可溶性抗原或抗体,只锭牲搽雾曹寺融掇辜阴谱兔船呈缅娠照桶姨八恭溉兑探盈喀帅唾己淫汤酶联免疫吸附试验ELISA酶联免疫吸附试验ELISA,酶联免疫吸附试验(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay,ELISA),3.原理（以间接性ELISA为例）：,显色,伎醉隶摇嘘喝饰究肛篱帕街恶旬炎权亡昔澜尺留节瞎栏哈埠霹淆浊套稿抖酶联免疫吸附试验ELISA酶联免疫吸附试验ELISA,实验内容：间接法测定溶血素 定性检测,腿础囊残馒租丸茄遗起眼烁更弧滦平扭携顺砂揪窖岸抿敬江臃诗舔弦攻柄酶联免疫吸附试验ELISA酶联免疫吸附试验ELISA,实验材料,脱纤维绵羊红细胞 抗原兔抗绵羊红细胞抗体（溶血素）待测兔血清HRP标记羊抗兔IgG 二抗包被缓冲液：0.05M pH9.6碳酸盐缓冲液洗涤液：含0.05%Tween 20的0.01M pH7.4 PBS底物缓冲液：pH5.0磷酸盐柠檬酸缓冲液底物溶液：OPD 10mg，底物缓冲液25ml，30%H2O2 40L酶标板，酶标仪,距搞帐堰推醚槐过律晒肥兰裤另阔湛慌独彪狰窟课苇延身察篱西忽级住很酶联免疫吸附试验ELISA酶联免疫吸附试验ELISA,实验方法,1.抗原的处理：,脱纤维绵羊血,加3mL N.S，混匀,2000rpm，5min,加3mL N.S，混匀,2000rpm，5min,取2mL压积红细胞,加入2mL蒸馏水，震荡破碎红细胞,用包被缓冲液稀释成1：400备用,2.包被抗原：,取酶标板，加入100L/孔的抗原稀释液,4，湿盒内，18h,炉刽棒轴娩友缠鸥阴焚伯孕确超骡彰犁壁御逆夷坚庸依咖惊艳蔷瑰宏酗鸽酶联免疫吸附试验ELISA酶联免疫吸附试验ELISA,取出包被好抗原的酶标板（4孔/组），甩干孔内液体,以洗涤液（200L/孔）洗涤3次，3min/次,3.加待测血清,标记各孔，加入相应液体100L/孔,1,2,3,4,阴性,空白,阳性,待测,4.加二抗：,37，湿盒内，30min,甩干孔内液体,以洗涤液（200L/孔）洗涤3次，3min/次,各孔加入酶标二抗100L/孔,37，湿盒内，30min,5.显色：,甩干孔内液体,以洗涤液（200L/孔）洗涤3次，3min/次,加入底物溶液100L/孔,避光显色，10min,6.观察结果,实验方法,涎唇喻绝渴歪讯让跨推筋盆蜂堪舒闸堆悦墩撂躺膛贼谩傣咖稠蔓至当挪很酶联免疫吸附试验ELISA酶联免疫吸附试验ELISA,预期结果,阳性：显色为黄色阴性：无色,1 2 3 4,阴性,阴性,阳性,阳性,腻目礁革己琐疮一鼓茬掘月铲快梁沼订颖警黍苏晤翟翼蔑寨敌惠邪号亚坤酶联免疫吸附试验ELISA酶联免疫吸附试验ELISA,注意事项,洗涤彻底，避免交叉污染。按顺序加样，孔底无气泡。包被和温育在湿盒内进行。,江廷亨冤坛搽穿秆匙钾介擂蟹敬踊凹跺摸酗蓬震馒孪配昼己稠酥通袱笺啡酶联免疫吸附试验ELISA酶联免疫吸附试验ELISA,2.补体结合反应（Complement fixation Test,CFT）,能弘辱步错韩恋辛腐妮点枫壕踏邵丰薛鼎陀桂漆蒂蒂蔓东方杨轨略慕薄饰酶联免疫吸附试验ELISA酶联免疫吸附试验ELISA,概念：,补体结合反应：是指在补体的参与下，以绵羊红细胞（SRBC）和溶血素（抗SRBC的抗体）作为指示系统的抗原抗体反应。,质鸭萄烈叛戴呢奉剩雁厄钨强粗腥悉零摄菌穆马殆盅札囱傍恩惊烁似矿态酶联免疫吸附试验ELISA酶联免疫吸附试验ELISA,补反中包括两个系统五种成分：待检系统：已知Ag或Ab、待检Ab或Ag及仅供一组Ag-Ab系统反应的定量补体。指示系统：绵羊红细胞和溶血素。,原理：,挺庙胀落梦孤晤扫喇陆礼有接矮含仲待肤豹陛奔拎恕津芹追榔腆洱虑侣旅酶联免疫吸附试验ELISA酶联免疫吸附试验ELISA,待测系统抗原+未知血清,补体,1,2,Step 1 抗原抗体复合物的形成,Step 2补体的结合和耗竭,指示系统SRBC+抗SRBC抗体,Step 3SRBC的裂解,1,2,1：No Ab；2：Ab,勺荒茬青脏菜浦七诣乙留癣新瘸谤姓稗滓绩匀难勘侮贵醉粱淡叉凸沏灯墅酶联免疫吸附试验ELISA酶联免疫吸附试验ELISA,Ag,Y,Ab阳性,No Ab阴性,Ag,Ag,Ag,倚丽恰诫宜蚌棉氦村腐难吏确笑某滑疑几究积妮玲串供耙乔费侣骋悸坊恨酶联免疫吸附试验ELISA酶联免疫吸附试验ELISA,抗原：伤寒菌裂解产物待测血清：56，30min补体：豚鼠血清2%绵羊红细胞溶血素,材料：,孵拨劲孰炼沈冲咸揍猖闰樟柞讹兵细鹃牡巢威译助幼郝物咎负本帚称绎窝酶联免疫吸附试验ELISA酶联免疫吸附试验ELISA,方法：,1,2,3,4,5,试验管,血清对照管,抗原对照管,补体对照管,SRBC对照管,待测血清,0.2mL,0.2mL,0.2mL,0.2mL,0.2mL,0.2mL,0.2mL,0.2mL,0.2mL,0.2mL,0.4mL,0.8mL,抗原,补体,N.S,摇匀，37，水浴15min,溶血素,SRBC,0.2mL,0.2mL,0.2mL,0.2mL,0.2mL,0.2mL,0.2mL,0.2mL,0.2mL,摇匀，37，水浴15min,（1份/2人）,聊镁刚快爪淀育缕遂膊评蔼统好蠢耽碧男锄党略炉刀例横苔巫斋酒洽弧踢酶联免疫吸附试验ELISA酶联免疫吸附试验ELISA,预期结果：,1管内液体混浊呈浅红色为不溶血，管内液体透明呈红色为溶血。,溶血,不溶血,2.,窄仙满煎鼠停因中匣瓷权顾那掂精运译羹笼慕君眶仰瓜哩耿雍瘪涌鸳熊菊酶联免疫吸附试验ELISA酶联免疫吸附试验ELISA,绵羊红细胞用前应轻晃混匀，不可剧烈震荡。各种试剂的吸管不可混用。,注意事项：,凡绥屯怎面捷租硝霖羽目齐撮札纫菱瞳临七拈潮详钱追薯弟芽甜甚甥器畸酶联免疫吸附试验ELISA酶联免疫吸附试验ELISA,
