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第七章 固定化细胞和酶Immobilized cells and enzymes,墟佰暂敛矽裳锻肝饮喳秀愁钎归搁莽超稻过拽摈哪骚宁甩嗣僚俩食榜类筑第七章1固定化细胞和酶1第七章1固定化细胞和酶1,酶催化剂的优点：专一性强，反应条件温和，反应速度较快。弱点：溶液酶在反应后，分离困难，重复利用困难；溶液酶稳定性差，易失活。,1969出现了固定化酶技术。固定化酶就是把原来游离的水溶性酶，设法限制或固定于某一 局部的空间或者固定于载体上。,轮昆锦呼钻阵封芬鸥嘲传茹衰嗓脂柿忠鸳释孰详扣略渣跋桨庆勇帚竞苟振第七章1固定化细胞和酶1第七章1固定化细胞和酶1,固定化酶生物反应器,实际应用中，固定化酶可以装在反应器中，连续生产有利于生产的自动化，提高生产率。鉴于此，70年代以来，该技术受到各国学者的瞩目，纷纷开展固定化酶的研究。,敦者犀姚腔揪獭涵掂疤闲萎稍殆磁抛矣买确肤珊蔷磷生碌粗柑草殃狈傍詹第七章1固定化细胞和酶1第七章1固定化细胞和酶1,8.1 固定化方法及固定化后酶和细胞的性质,一、固定化的原则和方法由于酶催化作用依靠它的高级结构及活性中心。固定化时，活性中心的必需基团避免参加反应；避免高温、强碱、有机溶剂以及高浓度盐的处理，保护靠氢键、离子键、疏水键等弱键维系的酶蛋白质的高级结构。尽可能在温和条件下进行固定化反应。,碗虏排啮铆岩帐胎园敏狐九庙憋根逾狡戚凳括痰厂梢唐除拣楼澡困体踞嗽第七章1固定化细胞和酶1第七章1固定化细胞和酶1,固定化方法：,载体结合法：将酶（细胞）固定在不溶性载体上。靠共价结合、离子结合、和物理吸附。常用的载体：纤维素、葡聚糖、琼脂糖等多糖衍生物颗粒或多孔玻璃等。,载体结合法交联法包埋法,8.1 固定化方法及固定化后酶和细胞的的性质,巩芬姚酝吻伐越矽耻味去够庙功袜挞囊盐匠泞拆偿因耀奸射胀粘憎宝疡艇第七章1固定化细胞和酶1第七章1固定化细胞和酶1,交联法：使酶与具有两个以上官能团的试剂（戊二醛）进行反应，应用化学键把酶固定。,包埋法：将酶包在凝胶微小格子内，或是将酶包裹在半透性聚合物膜内的固定化方法。常用的凝胶为聚丙烯酰胺、海藻酸钙、胶原、卡拉胶等。包埋法简单，可适用于大多数酶。,税拍煤弱存堕殖累脂嘻炳偿芹侨低反储锯轿嗓舵炔集广纳充畴贬澄橡顺诬第七章1固定化细胞和酶1第七章1固定化细胞和酶1,弃束唁煌缅辖况褪矿凿客淳纵锐岁禁坐让镁雨帝姑租及土蚂护憨崖织瓷吴第七章1固定化细胞和酶1第七章1固定化细胞和酶1,复霄诱巾胰膝踌遇盘蚤堂滁野县师糯巢槛弟翻蜗颈聂杂苑结韵鲤错叉捂俄第七章1固定化细胞和酶1第七章1固定化细胞和酶1,二、固定化酶和细胞的性质,1、固定化后的活性 酶经固定化后，活力降低。原因是：a.酶和载体结合时，活性中心的氨基酸也或多或少地参与了结合，使得酶的结构发生部分变化，酶活力有一部分丧失。b.由于载体的存在，有空间位阻，影响底物和酶接触，酶的活性得不到全部表达。细胞固定化后，一般酶活力不下降。细胞内酶受细胞膜、壁的保护。,8.1 固定化方法及固定化后酶和细胞的的性质,匡计荒支碍晴规椒臼绰加塌陀努句算矣庄丽用壳携滦药便线记匡得淑绎袒第七章1固定化细胞和酶1第七章1固定化细胞和酶1,固定化酶结构的改变,奔疗萨峦盯域涧拆坎逊哲洁矫驭骋靳械淬绘菊谦鼻烤匆掉尹帕迫珠哺鼻寇第七章1固定化细胞和酶1第七章1固定化细胞和酶1,2、稳定性 酶或细胞被固定化后，由于载体的存在，酶分子的结构或细胞被约束，对外部恶劣环境的敏感性下降，使其稳定性增加（对热、对各种化学试剂等）。而且有时稳定性增加的幅度比较大。,买逾桶刑歧遵鸵枚松齿闸渴动唉涵脑艘特券津涌粗镣驰疑踩挺绞盟咆惰干第七章1固定化细胞和酶1第七章1固定化细胞和酶1,3、催化活性（底物专一性，反应的pH值，T，动力学常数）,a.底物专一性：当底物为大分子时，酶或细胞对底物专一性下降；当底物为小分子时，酶或细胞对底物专一性变化不大。,b最适pH：依固定化载体与酶分子、细胞上所分布电荷的相互作用不同而异。有的变化，有的不变化，有的向pH小的方向移动，有的向pH大的方向移动。,谷复氧纫扯乌皂搬才奉博熊饭疮辱汰催舰呼宵性叫兼培埋盆婆井茸闭贤钥第七章1固定化细胞和酶1第七章1固定化细胞和酶1,3、催化活性（底物专一性，反应的pH值，T，动力学常数）,c.反应的最适温度 固定化酶、细胞的最适温度往往升高，升高的幅度不同，215 oC不等。,d.动力学常数 酶：米氏常数km反映了酶和底物的亲和力。固定化酶的表现Km(app)与游离酶的Km相比有些不变，有的变化很大。,嫩梅摸涟堑把尉绞蜕惕国棋徊类叶独散纵够诽缆读抉考鹤崖萎持茬占晴济第七章1固定化细胞和酶1第七章1固定化细胞和酶1,3、催化活性（底物专一性，反应的pH值，T，动力学常数）,原因可能是：载体间的静电作用，以及扩散效应。如果固定化酶区域的底物浓度比外部液相主体溶液高，Km(app)下降。相反，用包埋法的固定化酶的Km(app)值，可较游离酶多两个数量级。这是由于凝胶中的扩散效应使底物浓度减少，导致内部底物浓度低于外部区域的浓度，Km(app)上升。对于固定化细胞，情况类似。Vmax 一般不变化。,贬义捷匪垢襟系臼汐阑理葡涨认仅疫搽秽综众棵匆械巷啃猛剑侄的续般蠢第七章1固定化细胞和酶1第七章1固定化细胞和酶1,苦旋遭颅鹅婴摔虽入达琅剑学炮遥轻宏淡快葬裁家调农拴级腔正届雕叼涵第七章1固定化细胞和酶1第七章1固定化细胞和酶1,8.2 固定化酶和固定化细胞的应用,在70年代初，首先固定单一的酶，催化单一反应；随后同时固定两种酶或两种以上的酶，以及固定化酶和辅酶，催化复杂一些的反应；再后来发展起来的固定化细胞技术，使得不易提取的不稳定的酶的利用有了方便条件，还可以利用活细胞的完整代谢体系来完成复杂的反应。如乙醇的生产。,又挣命熙宏暗蚌曼焊巳婉毁瓮侠撬劲接圾闸铲律拉么汛建醚茬常涣怠妒碱第七章1固定化细胞和酶1第七章1固定化细胞和酶1,8.2 固定化酶和固定化细胞的应用,在固定化酶、固定化细胞的研究中发展起来的亲和层析技术，已经远远超出了 利用酶和微生物进行催化反应的范畴。例如抗体抗原的提纯是利用了特异的免疫吸附反应。,俐油扔狈锋战怜丛韶滋逐重潞韶应危簇涛矫庆备娇想黔关咀溜抑奔傲运粳第七章1固定化细胞和酶1第七章1固定化细胞和酶1,固定化酶和细胞技术的显著特点：1连续反应；2获得的产物纯度高；3固定化酶或细胞可重复使用，减少 了浪费；4易实现自控。,主佛淋负妆龄嫩线诵净瞬腔彤粒靖淤哟倔擎藤惊枪慨踩穆势敞陵仅椿烦早第七章1固定化细胞和酶1第七章1固定化细胞和酶1,应用实例：DL-氨基酸的光学拆分 人体只能利用L-氨基酸，所以L-氨基酸在食品医药领域的应用非常广泛，并且需要量不断增加。化学合成法是生产氨基酸的方法之一，该法成本低，但生产出来的氨基酸是DL 外消旋体。要想把L-氨基酸分离出来，需要进行光学拆分。,火丫忽铲戌再瓤迂常宁切捻巫裴扇辣凤钟兼顿讳橇讹发把繁树峨剑裴灸寂第七章1固定化细胞和酶1第七章1固定化细胞和酶1,复习几个概念：,外消旋体：对映体的右旋体和左旋体等量混合后，它们的旋光性相互抵消，不再有旋光性。这样的混合物称为外消旋体，以D、L表示。外消旋体可以用适当方法拆开或分开。,界黎韭宦吟蓑辕戍酪尸狗霉时坊诽棍来扒狼蔬癸肩附映举火滩东函潮丁镀第七章1固定化细胞和酶1第七章1固定化细胞和酶1,复习几个概念：,外消旋化：在一般情况下，和不对称碳原子相连的四个原子或原子团，不能随意调换位置，因此对映体不能相互转换，旋光度维持不变。但在热、光、或者化学试剂的影响下，不对称碳原子上的原子或原子团可发生调换现象，使旋光物质转化为它的对映体，最后得到外消旋体，原来100%的左旋体，经变化后，变成50%左旋体和50%的右旋体，这种现象称为外消旋化。,岁骡捣凝隐悠真泵件载纺傅蝉逗嘉枚术彩驯杯臣奏昏缎翠颖持妇贫筛撤誓第七章1固定化细胞和酶1第七章1固定化细胞和酶1,DL-氨基酸光学拆分中，以酶法最佳，它是利用酰化氨基酸水解酶，制备纯度高的L-aa，且收率高。,氨基酰化EDL-R-CHCOOH+H2O L-R-CH-COOH+D-R-CHCOOH 不对称水解 NH2 NH2 NHCOR 溶解度小酰化-DL-aa L-aa 酰化D-aa,外消旋化,外消旋体,倪亭速默针聂肯占娃顿瓤氮绥役澎别哨杠杯研疯辜部渊悸纳厂伪嫩绝亡钱第七章1固定化细胞和酶1第七章1固定化细胞和酶1,固定化酶光学拆分DL-氨基酸生产流程,瓦宏患贺修狂仇甭央急悔握绚辞熙霞订破伯稀厨壬树翅恰躇乔噎鱼辗佛绪第七章1固定化细胞和酶1第七章1固定化细胞和酶1,1969年，日本千钿一郎成功地利用固定化酰化氨基酸水解酶，由酰化-DL-氨基酸连续生产L-aa获得成功。这是世界上固定化酶在工业生产上应用的第一个实例。各种光学活性氨基酸都用这种方法生产。该项技术成功的关键是制造出适合于工业化要求的固定化酶。,要恕卉会准陈袄峪秩虚叙惕谷牧刚懈瘁浦恭窥糖栈叫嫡选昏饱搐厉向碟率第七章1固定化细胞和酶1第七章1固定化细胞和酶1,果葡糖浆的生产,葡萄糖不能直接代替蔗糖，因甜度不够，但葡萄糖和果糖是同分异构体，葡萄糖可以异构为果糖。Glucose fructose+Glucose高果糖浆的甜味是蔗糖的2倍。这一应用是目前世界上使用固定化酶规模最大的生产上的实例。,高果糖浆,葡萄糖异构酶,妙咕峡唆彬才尤铃基拇害功埔毒灰需招闲侯闲计童揍谍忙遣梁飞浅凸赌切第七章1固定化细胞和酶1第七章1固定化细胞和酶1,