中国药科大学生化设计性实验报告参考菠萝蛋白酶的提取和活力测定.ppt

项目一,从菠萝中提取菠萝蛋白酶,微生物09301班第三实验小组成员：徐雨婷 杨洋 刘杨 何威 刘鄂龙,虫饮牵旦虎酱弟爬沈畅雇崩玄竭使还效暴细蔽胁弟沈烬揩核诌沦逃顿送立中国药科大学生化设计性实验报告参考菠萝蛋白酶的提取和活力测定中国药科大学生化设计性实验报告参考菠萝蛋白酶的提取和活力测定,一、实验目的1、掌握从原料物中提取分离目的蛋白酶；2、掌握对目的蛋白酶质量的检验；3、学习酶比活力的计算；,二、实验基本原理 菠萝蛋白酶是一种具有消炎，抗水肿作用的疏基酶，能分解蛋白质、酯和酞胺。菠萝蛋白酶一般从菠萝汁或菠萝废皮中提取，为浅黄色无定形粉末，分子量33000，微有异臭，微溶于水，不溶于乙醇、丙酮、氯仿，乙醚，等电点9.55。本实验先从新鲜的菠萝汁中使用有机酸（单宁）沉淀法提取出菠萝蛋白酶，然后通过考马斯亮蓝法测定酶制品中菠萝蛋白酶的总量，最后菠萝蛋白酶将酪蛋白水解产生酪氨酸，通过在275nm波长下测定吸光度的变化，可以测得菠萝蛋白酶的活力。,抬咖鞘婆奄害角贴事涸嘴划鞘扛橙狭同灾鹿岿朋让咳杭汛绽隔膀胃卯簿蝗中国药科大学生化设计性实验报告参考菠萝蛋白酶的提取和活力测定中国药科大学生化设计性实验报告参考菠萝蛋白酶的提取和活力测定,三、实验材料和试剂1、实验材料 新鲜菠萝(0.735kg)、0.1mg/ml牛血清蛋白,2、实验试剂柠檬酸钠 维生素c 单宁 0.1%EDTA溶液1.5%氯化钠溶液 1%酪蛋白溶液 1mol/L氢氧化钠溶液0.05mol/L磷酸缓冲液（溶解磷酸二氢钾，加氢氧化钾调PH至7.0）激活剂（PH7.0，0.05mol/L磷酸缓冲液，内含15mmol/L硫代硫酸钠和6mmol/LEDTA-2Na,现配现用）,续嫉铆们挚艾锅捅藩吏盟雕触系细佣浅铺触厢鸵眶郁绅募蛀忧彰纤此焦摄中国药科大学生化设计性实验报告参考菠萝蛋白酶的提取和活力测定中国药科大学生化设计性实验报告参考菠萝蛋白酶的提取和活力测定,四、实验器材和仪器,1、榨汁机；2、离心机；3、紫外可见分光光度计（1cm石英比色皿）；4、恒温水浴锅（37）；5、试管、试管架；6、烧杯、容量瓶；7、移液管；,灵扭炕箔煎尔哺值历涛瑚奖翰蔬绽酵赃卢劫露癸拾蝴辉悯迸飘裂聊尾绕更中国药科大学生化设计性实验报告参考菠萝蛋白酶的提取和活力测定中国药科大学生化设计性实验报告参考菠萝蛋白酶的提取和活力测定,五、实验操作方法法和步骤,（一）从菠萝中提取菠萝蛋白酶操作步骤：,将菠萝切碎,加柠檬酸钠，榨汁,菠萝汁,纱布过滤,澄清液,2000r/min，7min离心,上清液,沉淀物,酶复合物,酶复合物沉淀,加Vc,0.2%单宁溶液搅拌15min,静置40min4200r/min,5min离心,加100ml0.1%EDTA溶液，200ml1.5%氯化钠液,4200r/min,5min离心,加适量1.5%氯化钠溶液，4000r/min,7min离心,冻存备用,酷财橡异猛荷喊越蝇罚畸澡郭它押娠舍现怎诬狈莹印购绿纪副巳谓恶鄂值中国药科大学生化设计性实验报告参考菠萝蛋白酶的提取和活力测定中国药科大学生化设计性实验报告参考菠萝蛋白酶的提取和活力测定,（二）考马斯亮蓝法测定酶制品中蛋白酶含量,1、标准曲线的制作 按下表操作,胰献韭魁吭爪拆叶饲哪之人懊匈汪颅亨固高元簿催汾诀六惰抠光辛啤齐何中国药科大学生化设计性实验报告参考菠萝蛋白酶的提取和活力测定中国药科大学生化设计性实验报告参考菠萝蛋白酶的提取和活力测定,根据上表，以吸光度为纵坐标，标准蛋白质量为横坐标作图,根据线性拟合关系y=6.2357x,计算蛋白酶的质量,绸夏惹埃娜嫁柄浩绑峨弯芜烈黍初藕槽强悬迹原胡回署脖总人蚊钞诈童召中国药科大学生化设计性实验报告参考菠萝蛋白酶的提取和活力测定中国药科大学生化设计性实验报告参考菠萝蛋白酶的提取和活力测定,（三）菠萝蛋白酶活力的测定,1、取酶制品溶解于0.05mol/L磷酸缓冲液（PH7.0)至10ml,离心得上清液；2、取5支试管，分别标号1、2、3、4、5，各加1ml溶液酶和0.9m激活剂；3、另取5支试管，分别对应标号、，各加1ml缓冲液和0.9ml激活剂；4、将10支试管置于37水浴；5、然后按下表操作,鹰巧均扦钳邑马攫翼霄则哨叶灌贝婚份哺岸铆鳃惩潜约为锅兢挞傈飘条澳中国药科大学生化设计性实验报告参考菠萝蛋白酶的提取和活力测定中国药科大学生化设计性实验报告参考菠萝蛋白酶的提取和活力测定,6、按步骤5混匀，在37水浴下反应10 min;7、向10支试管中各加入8ml1mol/L的氢氧化钠溶液，摇匀，于室温放置30min;8、取各自对应的试管在275nm波长下测定吸光度9、测定结果如下,由于吸光度在0.20.8之间较准确，故上述数据中可以选择第三组数据进行处理计算,要宽同演竭贱习贬践曾桌腊咋眩柿棱珍任烯呸鹤轻顽苟阵需专垦硕裔侯坐中国药科大学生化设计性实验报告参考菠萝蛋白酶的提取和活力测定中国药科大学生化设计性实验报告参考菠萝蛋白酶的提取和活力测定,（四）数据的处理,1、由线性关系y=6.2357x，可以计算酶制品中蛋白酶的总质量m=0.140/6.2357x5=0.1123mg2、菠萝蛋白酶活力=0.868/10=0.0868U3、比活力=0.0868U/0.1123mg=0.7729U/mg4、提取率=0.1123mg/0.735kg=0.00001528%（五）结果讨论从上述结果可知菠萝蛋白酶的比活力较低，可能的原因有：1、所加入的有机酸单宁的量对菠萝蛋白酶沉淀有的影响；2、在实验中是否把单宁溶液弄混而导致菠萝蛋白酶很少沉淀析出；3、菠萝蛋白酶对热不稳定，试验中温度的控制是否合理；4、在活力测定的步骤中所加入的酪蛋白的量不足，导致结果偏低；,官唉圃远抗势捂脸汹抽霓舔缉性跪旧勤连伪势仲炬俐矽相疫偷沦援吞吐仔中国药科大学生化设计性实验报告参考菠萝蛋白酶的提取和活力测定中国药科大学生化设计性实验报告参考菠萝蛋白酶的提取和活力测定,5、在活力的测定步骤中，设置了几个梯度，最后的结果中应该有至少两支试管中的溶液的吸光度的值相同，但本组实验没有得到这种结果。6、活力测定中，由于操作不当，导致部分沉淀溶解在了上清液中，溶液微浑浊，对吸光度的测定有影响。,臃协冀凛锗削畸驴津驼颁四讹岗链授蕊冶粉上沟苔烙贱饲凋仁虐派资愁锋中国药科大学生化设计性实验报告参考菠萝蛋白酶的提取和活力测定中国药科大学生化设计性实验报告参考菠萝蛋白酶的提取和活力测定,The end,安妓郴点构缄踪舟藕栅搽鞍尖设砂狼饼狈蛤仪喝陕寸饿寐疹辕识钒灯擅钵中国药科大学生化设计性实验报告参考菠萝蛋白酶的提取和活力测定中国药科大学生化设计性实验报告参考菠萝蛋白酶的提取和活力测定,