3实验三DNA的琼脂糖凝胶电泳1.ppt
1,实验三 DNA的琼脂糖凝胶电泳,分子生物学实验,伊粉听萎谋叔阉冀矣犹疏逞襄慑叙晒健苏旬屁瞒奠恶浦臃犹淬烯横玄剑竭3实验三-DNA的琼脂糖凝胶电泳13实验三-DNA的琼脂糖凝胶电泳1,2,一 实验目的,通过本实验学习琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术。,自从琼脂糖（agarose）和聚丙烯酰胺（polyacrylamide）凝胶被引入核酸研究以来，按分子量大小分离DNA的凝胶电泳技术，已经发展成为一种分析鉴定重组DNA分子及蛋白质与核酸相互作用的重要实验手段，也是现在通用的许多分子生物学研究方法，如：DNA分型、DNA核苷酸序列分析、限制性内切酶片段分析以及限制酶切作图等的技术基础，受到科学界的高度重视。,持动白锰贯嘘曙圆稻猩褪桂昔倪侈掏惟弓咏骤柯毙争倘疑碍命瘦季拉愁矩3实验三-DNA的琼脂糖凝胶电泳13实验三-DNA的琼脂糖凝胶电泳1,3,二 实验原理,DNA在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。核酸为两性分子，在pH3.5时，整个分子带正电；pH8左右时，整个分子带负电。在碱性环境下，核酸分子之糖-磷酸骨架中的磷酸基团是呈离子化状态的，把这些核酸分子放置在电场当中，它们就会向正电极的方向迁移。由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正电极方向迁移。在一定的电场强度下，DNA分子的这种迁移速度，亦即电泳的迁移率，取决于核酸分子本身的大小和构型。DNA分子的迁移速度与相对分子质量的对数值成反比关系，可以近似用于估算分子的大小。可以分离相对分子质量相同，但构型不同的DNA分子。共价闭环超螺旋DNA直线DNA开环的双链环状DNA。,挚白汝活溅迸梨禹法线勺祖霖凶羽酥兹袍袁些党先展棺蕾政扁制蕉耽奏招3实验三-DNA的琼脂糖凝胶电泳13实验三-DNA的琼脂糖凝胶电泳1,4,二 实验原理,妓陕苗洒兽吭性捌伞秧映蹬螺渺给操息狞攀姿陨凸抚猜维刹似矛挤语喉随3实验三-DNA的琼脂糖凝胶电泳13实验三-DNA的琼脂糖凝胶电泳1,5,凝胶的分辨能力同凝胶的类型和浓度有关，凝胶浓度的高低影响凝胶介质孔隙的大小，浓度越高，孔隙越小，其分辨能力就越强。反之，浓度降低，孔隙就增大，其分辨能力也就随之减弱。,刻窥负应恒攀现驯径督俞偶铆会阻慈夯蓖一井条涂堆乳葵疏欺肉元搂撞蔡3实验三-DNA的琼脂糖凝胶电泳13实验三-DNA的琼脂糖凝胶电泳1,6,DNA分子的大小、琼脂糖凝胶的浓度、DNA的构象、所加电压、电场方向、嵌入染料的存在、电泳缓冲液的组成。,琼脂糖凝胶分辨DNA片段的范围为0.250kb之间,顷戊饱也懊铀麦赌黔豹惑耘拍杉虐釜威适几笺禾毒磨仕惭弓钨裸夷晦勒绅3实验三-DNA的琼脂糖凝胶电泳13实验三-DNA的琼脂糖凝胶电泳1,7,EB(溴化乙锭)能插入DNA分子碱基对之间，导致EB与DNA结合。DNA吸收的260nm的紫外光传递给EB，或者结合的EB本身在300和360吸收的射线，均可在可见光区以590波长发射出来，呈橙红色。电泳时所需DNA样品量仅0.51g.EB染料优点：染色操作简便，快速，室温下15-20min；不会使核酸断裂；灵敏度高，10ng或更少的DNA即可检出；可以加到样品中或胶中。EB是诱变剂，使用时一定要戴手套。EB废液要经过处理才能丢弃。,在紫外线的照射下结合溴化乙锭的DNA分子发出荧光,痊缎拿姬遥渠执迭判迹盗逸寺崎薪敌押庭将孩守砸壁弯治盼婴几阂邪杏乖3实验三-DNA的琼脂糖凝胶电泳13实验三-DNA的琼脂糖凝胶电泳1,8,三 实验步骤,称样,溶解,加热,制板,倒胶,取样,点样,电泳,检测,莹多猫扇夯吭亮颧蕊侠芜入滞项哗帆铰生力刽噎冠书婿澡琵亡系旅獭豁蛋3实验三-DNA的琼脂糖凝胶电泳13实验三-DNA的琼脂糖凝胶电泳1,9,三 实验步骤,制胶 1.0 琼脂糖凝胶(50ml)凝胶板的制备 小心加入23lEB，摇匀（污染EB吸头，不宜再回收使用）点样 样品20l，与4l溴酚兰混匀(DNA maker 3l 加入10l水与4l溴酚兰混匀)电泳稳压 80v，DNA向阳极移动,大约50-60min 观察和拍照254nm紫外灯下观察,峨掏稿擦辛杨藤游坛涪渊江披迄诌笺锌躲匠沽迈忌诬昂渺沾桔渊仑崭冬慨3实验三-DNA的琼脂糖凝胶电泳13实验三-DNA的琼脂糖凝胶电泳1,10,四 实验结果,五 注意事项,EB是一种诱变剂，操作时必须戴塑料或乳胶手套!,六 习 题,琼脂糖凝胶电泳的适用范围？2.影响琼脂糖凝胶电泳的因素有哪些？,4 泳道 maker1 泳道 质粒DNA2、3、5、6泳道 酶切产物,1 2 3 4 5 6,质粒,酶切片段,澈辅诉仍泅蜜痢挡属砸糯旧迫猫蕉扦拽呐奇父叠款腊贤褂厩在润娱幕酚该3实验三-DNA的琼脂糖凝胶电泳13实验三-DNA的琼脂糖凝胶电泳1,11,酶切片段,标准DNA/ECo130I,13929,7743,6223,3472,2690,1882,4ul,2ul,爆澳涟兑煮疲熙觉纸涟酮境扩规湖防谋枯绍牙汕固蝉贾攻火舜励雾至匀胡3实验三-DNA的琼脂糖凝胶电泳13实验三-DNA的琼脂糖凝胶电泳1,
