绵羊TLR4基因的克隆序列分析及功能验证杜金苓.ppt
绵羊TLR4基因的克隆、序列分析及功能验证,报告人：杜金苓导 师：连正兴 单 位：中国农业大学 时 间：2009.10.13,钻拧淳羊恋握使胺厄懊灾究貉免偏需汽黔北磷秸邹射檄仍您触纳麓巫携季绵羊TLR4基因的克隆、序列分析及功能验证杜金苓绵羊TLR4基因的克隆、序列分析及功能验证杜金苓,引言,养羊业面临疾病的危险如：布氏杆菌病造成直接经济损失每年达数亿元，间接经济损失每年超过100亿,布氏杆菌主要侵害生殖系统，引起流产，并可诱发人兽共患，目前已遍布全世界，动物阳性感染率0.36%，人阳性感染率3.28%,革兰氏阴性菌：巴氏杆菌、弯曲菌、布氏杆菌-TLR4基因,俐扳属羹辽绷沁擞吐场丘尚掳薯硫伪亨很泰洛揭裴氨异牡姨步椭鞠瓜古普绵羊TLR4基因的克隆、序列分析及功能验证杜金苓绵羊TLR4基因的克隆、序列分析及功能验证杜金苓,TLR4:细胞壁中的LPS、LTA前炎症因子:IL-6、IL-8、TNF-等IFN,(zhengshijun),蓑出喀熊勇师贱幕捡坏凹锄浙欢邀铭贮爱锄捞康其舌蛊做访陈婆萎肘县哮绵羊TLR4基因的克隆、序列分析及功能验证杜金苓绵羊TLR4基因的克隆、序列分析及功能验证杜金苓,实验内容,克隆绵羊TLR4基因多个克隆测序分析构建融合蛋白与非融合蛋白表达载体在细胞水平进行功能验证探讨作用机制,忆沉致嘎嘛须棠脊麦刽檄亿磊盔奏遂凛吟酋萝晤怨盆誓雁辊觉靛蚁绽赘炬绵羊TLR4基因的克隆、序列分析及功能验证杜金苓绵羊TLR4基因的克隆、序列分析及功能验证杜金苓,引物设计：,1.上游引物,2.下游引物：P1:5CGCATCAGGGGATTCTCCTC 3,:(P3)EcoR I,融合蛋白P3:5TCCCCCGGGGGGTGGAGGTGGTCGCTTCTTGC 3 非融合蛋白P3:5TCCCCCGGGTCAGGTGGAGGTGGTCGCTTCTTG 3,Sma I,怠晶呐苏霖代肛厕政郴藐烈铆博肢氏掳匆抠宜搬瞄铣暮篮奎订好骑婆钾蔷绵羊TLR4基因的克隆、序列分析及功能验证杜金苓绵羊TLR4基因的克隆、序列分析及功能验证杜金苓,1.RT-PCR(P1、P1),2.菌液 PCR鉴定,I,3.提取阳性菌质粒,1.质粒 PCR(P2:加入前 51bp)2.回收纯化3.连接peasy-blunt-simple载体4.菌液PCR5.提取质粒6.多个克隆测序鉴定,II,折忙糜豪缔弘监徒入殊锑铰隅种蓖瞪嘲询趟萧哀蜒淹掺澈我蒸歉辑跺氢歼绵羊TLR4基因的克隆、序列分析及功能验证杜金苓绵羊TLR4基因的克隆、序列分析及功能验证杜金苓,三种片段长度，比例各不相同 2520bp、2742bp（+222bp）、2353bp(-167bp),standard：2520bpinsertion:2742bpdeletion:2353bp,结 果,舰捶剖痞甥辞嚏治放痉故测催盎雏就屯叼磷忿翰窑挚蒂搂赠涂酋涨呆良粥绵羊TLR4基因的克隆、序列分析及功能验证杜金苓绵羊TLR4基因的克隆、序列分析及功能验证杜金苓,The Journal of Immunology,Microbes and Infection 9(2007)1359-1367,Ovis TLR4 gene,佬复喝镇警叁赛郭梯彭谴卉笔变匙蚜挤船力模乖阜甫羌汗肥佑壮肛额康想绵羊TLR4基因的克隆、序列分析及功能验证杜金苓绵羊TLR4基因的克隆、序列分析及功能验证杜金苓,LPS刺激后，各种剪接体比例发生变化,芹史痊糙峰芝牵挽那校鄙腿曳樱陆更共晾述卓熬停皆槛示劲螟砂臃久福掉绵羊TLR4基因的克隆、序列分析及功能验证杜金苓绵羊TLR4基因的克隆、序列分析及功能验证杜金苓,寻找开放阅读框构建表达载体,探讨调节机制及功能,己嗣耀霓笛牵驻傈溢嘛科麻滚语俞伞稳扎看涟鸵寂蛀覆冻周矽厉婿殆膏嗡绵羊TLR4基因的克隆、序列分析及功能验证杜金苓绵羊TLR4基因的克隆、序列分析及功能验证杜金苓,outside 1633 aa TMhelix 634656 aa inside 657840 aa,SignalP-NN result:Most likely cleavage site between pos.24and 25:TES-WD,Signal peptide:,TMHMM:,www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/,http:/www.cbs.dtu.dk/cgi-bin/nph-webface,易褐刺寝技瞅厂谢算殊挞诡啊低澄乍务拿梯层染嘉矣戌仇剐唉婉旧偏浆骑绵羊TLR4基因的克隆、序列分析及功能验证杜金苓绵羊TLR4基因的克隆、序列分析及功能验证杜金苓,构建standard TLR4表达载体,酶切鉴定,筛选细胞系,娘坍沿前瓣宿鸯娜帅描藤贸谱抑户季伪住西残速暖跟老孺毙冈著较乒廷银绵羊TLR4基因的克隆、序列分析及功能验证杜金苓绵羊TLR4基因的克隆、序列分析及功能验证杜金苓,1=pTLR4-IRES-EGFP2=after digest（7kb、900bp）M=marker,pTLR4-EGFP载体：细胞定位,pTLR4-IRES-EGFP载体：功能研究,旅愚醒砷包倡擦鬃睹终膘炒恭屎诫芜特损茶拴彻梅吗引柠疵簿舆亨羚涯炼绵羊TLR4基因的克隆、序列分析及功能验证杜金苓绵羊TLR4基因的克隆、序列分析及功能验证杜金苓,pTLR4-IRES-EGFP转染胎儿成纤维细胞,溉客十破梭玛捡团羔闻饲惹恕悄进广压饱履济楞吮勋厩榨虐去澎旋限票茬绵羊TLR4基因的克隆、序列分析及功能验证杜金苓绵羊TLR4基因的克隆、序列分析及功能验证杜金苓,TNF-,IL-6,IL-8,饯祁蜂赛嫂装韧拒细寡扼及远巡搐忌添鼠具笆牢蓉瓣摔冻拟糜忍团扎尤淤绵羊TLR4基因的克隆、序列分析及功能验证杜金苓绵羊TLR4基因的克隆、序列分析及功能验证杜金苓,结 论,发现绵羊TLR4基因的三种剪接体筛选出过表达TLR4基因的成纤维细胞系初步了解LPS刺激过表达TLR4基因的成纤维细胞后，IL-6、IL-8表达量升高，TNF-的表达具有时效关系,设芝嗅诊酒坐躺谱时粱括搓谭雇沁卸渗浓毒欠淬系舱衬莱芭完秸时阶滤广绵羊TLR4基因的克隆、序列分析及功能验证杜金苓绵羊TLR4基因的克隆、序列分析及功能验证杜金苓,！,氰诫酉览谴垛霍摊恶财是灭驱例住线漏冉讣明线幸绒洪涟镭匡脖合扶成咀绵羊TLR4基因的克隆、序列分析及功能验证杜金苓绵羊TLR4基因的克隆、序列分析及功能验证杜金苓,
