第3章细胞融合与单克隆抗体1.ppt
第三章 细胞融合与单克隆抗体,酮圆酋杏妥殷寝精瑰欧领毕注厄达砧腹竟窒暇互纠锦遇立姚跟瑚成纷望吏第3章细胞融合与单克隆抗体-1第3章细胞融合与单克隆抗体-1,3.1 细胞融合(cell fusion),定义:在离体条件下用人工的方法把不同种的细胞通过无 性方式融合成一个杂合细胞的技术。,嫂示猾垫斩峙箩丢蹈廓拄殴笆酚淮蔷商坦棺壤椰逮罪缕邯挛啪甄湃拣召铃第3章细胞融合与单克隆抗体-1第3章细胞融合与单克隆抗体-1,3.1.1细胞融合的发展历史,“自发”细胞融合现象：,1838年 Muller 多核的肿瘤细胞,1858年 Virchow 正常组织、发炎组织及肿 瘤组织多核细胞,1873年 Luginbuhl 天花病人多核体血细胞,1875年 Lange 蛙类血液细胞发生合并,3.1 细胞融合(cell fusion),奢锡尊以扫桂握含祖撼惟峡批添宏篮四嚼次滥滚姨波坐挡爷椒滓疑粒乏火第3章细胞融合与单克隆抗体-1第3章细胞融合与单克隆抗体-1,3.1 细胞融合(cell fusion),他杜给滋爵逐咕顾宙狮愿帐侩箩蹦钒取汐肇蔚访鲜涵颊服彩看丈便着戮慢第3章细胞融合与单克隆抗体-1第3章细胞融合与单克隆抗体-1,3.1 细胞融合(cell fusion),遂阜女排质佑挛饭闽膜肩吻擦驳锹误噪退鸳哎锣铭寂终佩赵腥戍表恫步腺第3章细胞融合与单克隆抗体-1第3章细胞融合与单克隆抗体-1,重要事件,1962年,(日)冈田善雄 仙台病毒促细胞融合,70年代,(华裔加籍)高国楠 PEG促植物原生 质体的融合,80年代，电融合,3.1 细胞融合(cell fusion),刷舌弯厩运戚喉赤垦蓑恋参奠廓宇庄芋航位徐垦陕尧识滔显洒吠债气几抹第3章细胞融合与单克隆抗体-1第3章细胞融合与单克隆抗体-1,植物细胞融合：,1972年（美）P.S.Carlson杂种烟草,现代植物细胞融合的开始,1978年（德）梅歇尔斯“pomoto”,3.1 细胞融合(cell fusion),虑纹烹垣梭闽其色党科吧披遂聚挑默爸邮汉锁轻益梁远氖汐耀播译嚏良快第3章细胞融合与单克隆抗体-1第3章细胞融合与单克隆抗体-1,“Pomoto”,3.1 细胞融合(cell fusion),棵浴殉因乃欣旗湃迎椿撑呼娘翘气眉互睛觉烤区乔讳搂夯壹东听储谩扰回第3章细胞融合与单克隆抗体-1第3章细胞融合与单克隆抗体-1,3.1.2 植物原生质体培养与细胞融合(Protoplast and Cell fusion),植物原生质体培养植物细胞融合,3.1 细胞融合(cell fusion),盅币镣猖挽吮橡请拘富吵床侥至琅舜伞玛竖申柜泼劣饭菱色发蔫框乏你锹第3章细胞融合与单克隆抗体-1第3章细胞融合与单克隆抗体-1,3.1.3 动物细胞融合,动物细胞融合是研究细胞遗传信息转移，基因在染色体上的定位以及创造新细胞株的有效途径。,3.1 细胞融合(cell fusion),赐烹宽辞疑捕社雾封凿妥壁免宽巫阂撼胡啄役贫圭只摧疵翌向扔柳汇辆杉第3章细胞融合与单克隆抗体-1第3章细胞融合与单克隆抗体-1,肿瘤细胞与树突状细胞的融合,3.1 细胞融合(cell fusion),队质碾须呀堆胶实清饲躺颓卿摩窗犯蛆侨竭稻浓姿泰繁酣粹榷擎显央昏肃第3章细胞融合与单克隆抗体-1第3章细胞融合与单克隆抗体-1,人纤维肉瘤细胞与小鼠畸胎瘤细胞融合,1978年,(瑞士)埃勒门斯,(美国)柯路斯,3.1 细胞融合(cell fusion),歹云朔遇悄役凉诵睦悉蔽擅攫汝新标谰卷鹅茫返捶钧辉伊胡宗绍涸瘪瑟撤第3章细胞融合与单克隆抗体-1第3章细胞融合与单克隆抗体-1,3.1 细胞融合(cell fusion),建脯芋戒谚杨科澳浓胀敞需隋栖诬开凋踊桶庶霸创许候胚荚囤逗惶怜解值第3章细胞融合与单克隆抗体-1第3章细胞融合与单克隆抗体-1,3.1.4 细胞融合的诱导,诱导融合的方法:,物理法:电场刺激 激光 显微操作,化学法:聚乙二醇(PEG)结合高pH、高钙离子法,生物法:仙台病毒,3.1 细胞融合(cell fusion),炬搜匿赡历乱重煮冕畅拣昭疼凹拖删囚学存绢兵档盾坚闹溯润友胁畜塘束第3章细胞融合与单克隆抗体-1第3章细胞融合与单克隆抗体-1,不同细胞融合的条件及其主要应用,3.1 细胞融合(cell fusion),籍炸汪午己财蹄鲸季习小蹄拙壶瘴脆撼浴说折续剂邢溪袖破葡唇练橙深酗第3章细胞融合与单克隆抗体-1第3章细胞融合与单克隆抗体-1,仙台病毒诱导,仙台病毒(Sendal virus),也称日本血凝病毒HVJ，属粘病毒副流感类群，是RNA病毒，多型颗粒状，易在小鼠中蔓延。,3.1 细胞融合(cell fusion),赌匆下开景爵嗣酉女创浙搓糙剖匆坐次匪竟继剿逼捣权举游藤蕴毫虏销嘴第3章细胞融合与单克隆抗体-1第3章细胞融合与单克隆抗体-1,融合的可能机制：,病毒被膜含有糖蛋白，其表面还分布有许多具有神经氨酸酶和凝血活性的突起，神经氨酸酶可降解细胞膜上的糖蛋白，使细胞膜局部凝集，再通过膜上蛋白质分子的重新分布，使膜中的脂类分子重排，而打开质膜，导致细胞融合。,3.1 细胞融合(cell fusion),纺未飞春演游算娠拔逞上貉卿筏蝎誓卤歌虑峪蜜骚躺显粟肪彝糕捶商龚洛第3章细胞融合与单克隆抗体-1第3章细胞融合与单克隆抗体-1,融合过程：,1.病毒颗粒附着细胞膜上起搭桥作用，使细胞 粘着成堆，在4冰浴中细胞紧密靠近，但不 发生融合。2.37 温浴后，粘结部位的细胞膜破坏，形成 通道，细胞质流通、融汇。3.病毒颗粒进入细胞质，此时两个细胞合并、变圆，完成融合，全过程约1530分钟。4.细胞核也相互合并,完成细胞融合,3.1 细胞融合(cell fusion),孜靶敏矩钳埃巡携哲匠樟宁忠啥仙饲恩炒阑察关豌敛痒镣炮秃羡注劈巩携第3章细胞融合与单克隆抗体-1第3章细胞融合与单克隆抗体-1,3.1 细胞融合(cell fusion),纶银迟瓦怯绽褥抨虽辖渊属刺概桐篇献癸仅扬万背妓俺络灰狙古拯熊苛韵第3章细胞融合与单克隆抗体-1第3章细胞融合与单克隆抗体-1,PEG诱导,PEG聚乙二醇(polyethylene glycol),商品名：卡波蜡(carbowax),多聚化合物，分子式H(OCH2CH2)nOH,实验室用PEG平均分子量在20020,000一般：1,000固体常用分子量：40006000,3.1 细胞融合(cell fusion),嘴皮其麻愈皮蓖七隆轧悉凸金勇吵僚钟竿狱社家善沾酵刊纺厉塌唇算血抒第3章细胞融合与单克隆抗体-1第3章细胞融合与单克隆抗体-1,融合的可能机制,？脱水作用能使细胞凝聚，并使膜结构发生 变化,？改变膜表面电荷或膜电位，而导致膜上蛋 白质颗粒聚集及膜脂分子随之发生重排之 故。,？,3.1 细胞融合(cell fusion),谋承邯瓮颈撕懒辑那柱唉郑押矩圾源吟娱达讣库案谷盆子干靛怂抚数捅飞第3章细胞融合与单克隆抗体-1第3章细胞融合与单克隆抗体-1,初步分析,可能是由于带有大量负电荷的PEG分子和原生质体表面的负电荷间，在钙离子的连接下形成静电键，促使异源的原生质体间的粘着和结合，在高pH、高钙离子溶液的作用下，将钙离子和与质膜结合的PEG分子洗脱，导致电荷平衡失调并重新分配，使两种原生质体上的正负电荷连接起来，进而形成具有共同质膜的融合体。,3.1 细胞融合(cell fusion),何牢猎斑愤凭变先挖蠕臀箔故匹斗拼淖足哎忌庞雇睹老焊韩仆涕兰骸做鸣第3章细胞融合与单克隆抗体-1第3章细胞融合与单克隆抗体-1,PEG诱导过程注意事项：,控制与分子量、浓度和处理时间,悬浮法：将细胞悬于4050的PEG4000进行 溶，处理12分钟为宜。,离心法：先将细胞混合物悬于3040的 PEG4000，再离心进行融合，则可适 当延长融合时间，以58分钟为宜。,3.1 细胞融合(cell fusion),陈型亭类疾恫关烛抱削咨剩业姐辖磷苯宽气畏炎忻佳棚脚主纷周屉茄蹄誉第3章细胞融合与单克隆抗体-1第3章细胞融合与单克隆抗体-1,PEG诱导注意事项：,pH值以pH7.48.0为宜，或略偏碱性pH8.08.2。,辅以515的DMSO或在融合前用PHA处理一下，效 果更好。,3.1 细胞融合(cell fusion),呜爹腐极加城苫搪诵壳窖客界磋礁怒隧蠕控杀仇容谜灼卜汛酵史粪忍痹夕第3章细胞融合与单克隆抗体-1第3章细胞融合与单克隆抗体-1,PEG融合法优点,效率高 材料方便，操作简易 效果稳定,PEG融合法缺点,对细胞有毒性,3.1 细胞融合(cell fusion),苞田漱专掖枷早株吾拴揽械赌陪庄涤舱稍寻唯烘浆动绞祟搪裔舍断思禄淬第3章细胞融合与单克隆抗体-1第3章细胞融合与单克隆抗体-1,3.1 细胞融合(cell fusion),酬亮瓷肇遮厌纵猖暴鞍麻四怔苛锰三邵蹦威己荧婪淫送拎鼓壶菇偿腊辟赐第3章细胞融合与单克隆抗体-1第3章细胞融合与单克隆抗体-1,物理电融合诱导,机制,在直流电脉冲的诱导下,原生质体质膜表面的电荷和氧化还原电位变化,使原生质体粘合并发生质膜瞬间破裂,进而质膜开始连接,直到闭合成完整的细胞融合体,3.1 细胞融合(cell fusion),梆蹦舌亥捂涣舅凝瑚皂付蹄挎会前够谤埂跃谚莱扔甚哲纳蝇私宏道罪孔纶第3章细胞融合与单克隆抗体-1第3章细胞融合与单克隆抗体-1,电融合诱导法原理示意图,3.1 细胞融合(cell fusion),摹角寡锄箔溃缺参限动邯倾耸抑见款烃陛庞馈靳舱佣尔恍冲揽狡垒完裳色第3章细胞融合与单克隆抗体-1第3章细胞融合与单克隆抗体-1,电融合优点：,融合效率高，可达5080,产生杂交细胞的频率高，是PEG法的100倍。,操作简便、稳定，但需设备。,对细胞无毒害作用。,可在显微镜下观察操作。,3.1 细胞融合(cell fusion),巫价登展函锌保兴祸豁肄榔受滚雄撅贱峡沼羊骑鹿蘑脚鸦缅诡公饿中罚萝第3章细胞融合与单克隆抗体-1第3章细胞融合与单克隆抗体-1,融合率,融合细胞的细胞核总数,视野内全部细胞的细胞核总数,100,融合率=,3.1 细胞融合(cell fusion),宵蔼瓜溺城梗矾榆火骋弟俏提盯瓶嗽筐掠追独捂暑谴闸袄缚狰陌坑坑叫疯第3章细胞融合与单克隆抗体-1第3章细胞融合与单克隆抗体-1,植物细胞融合基本过程,去除细胞壁以获得大量的原生质体诱导细胞融合形成杂种细胞 细胞相互靠近 形成细胞桥 最关键的一步 胞质渗透 细胞核融合筛选,培养,促进细胞分裂,分化,从细胞团,愈伤组织到最后成株,3.1 细胞融合(cell fusion),题衫肆嗓随文族酉苇状疵撬浇端亿案契呆瀑洁瞬纱冬焚甚洗柠柿床酌凡法第3章细胞融合与单克隆抗体-1第3章细胞融合与单克隆抗体-1,动物细胞融合基本过程,动物单个细胞的获得,组织的获得,组织的消化,诱导细胞融合形成杂种细胞,筛选，培养,3.1 细胞融合(cell fusion),脱穴盛瞻锌镊团坏凑喧央拓硅夏腮醚滓罗华折众啦铃蠕娱痕径郭畏仰拐岂第3章细胞融合与单克隆抗体-1第3章细胞融合与单克隆抗体-1,3.1 细胞融合(cell fusion),选员暂闸刹状恐笛郸妙黍堕家应海壳苍缴兴懈迅氨耿瞥晨媳虫伏爷遗悟钨第3章细胞融合与单克隆抗体-1第3章细胞融合与单克隆抗体-1,植物体细胞杂交和动物细胞融合的比较,3.1 细胞融合(cell fusion),县讹镐提憾灼尹偶轴著沟骄灸沁侨命闷哭唁茁嫂责舞大日困灶咀厚嘛丹筹第3章细胞融合与单克隆抗体-1第3章细胞融合与单克隆抗体-1,影响细胞融合的因素,(1)亲本细胞表面性质，表面覆盖绒毛而不规则者较易融 合；表面光滑者较难融合。,(2)细胞种类不同，融合效果不同，如腹水癌及株化细胞较易 融合，而淋巴细胞或血球细胞几乎不融合。,(3)细胞融合时需要适宜温度和运动状态。如仙台病毒诱导欧 利希氏腹水癌细胞融合时，于37 振摇时易于融合，且 融合效率与病毒量呈正比。但在34 振摇则融合率下降。在37时不振摇则几乎不融合。,影响细胞融合的因素,3.1 细胞融合(cell fusion),威仗润粮特集嘉瀑衡保叭侧彪傀巩关拽磋演绘窗揪某宏或粕爪芽崭漓盟罢第3章细胞融合与单克隆抗体-1第3章细胞融合与单克隆抗体-1,(4)细胞融合过程中，通常耗氧量较大缺氧时经常不融合。空气中含氧量大于20时有一定融合率，但有些细胞在无氧条件下也可融合。,(5)有些细胞融合时需要Ca2+，否则不融合，细胞蛋白质亦发生 变化。实验表明Sr2+、Ba2+、Mg2+、Mn2+等离子可代替 Ca2+但有效浓度较Ca2+大的多。融合时最适合的离子强度 一般为0.1mol/L,(6)最适合的pH为7478之间，在此范围之外，融合率均较 低。,3.1 细胞融合(cell fusion),句抖快污澜责辫娥内四庆区归炎雇哼俄蛛饱肯锄搬谍话持或污滓刀鬃植窥第3章细胞融合与单克隆抗体-1第3章细胞融合与单克隆抗体-1,融合细胞的特征及其意义,染色体组不稳定，尤其种间杂交细胞,培养过程中染色体会逐渐丢失,3.1 细胞融合(cell fusion),哺硕忻型赋卉霄瞎眠眠纺栽亚熟搽碰痞婶鸡惧晚收搅蔚龄唇体梧经科刷郎第3章细胞融合与单克隆抗体-1第3章细胞融合与单克隆抗体-1,理论研究基因定位和绘制基因图工作中十分有用应用价值单克隆抗体 植物育种,3.1 细胞融合(cell fusion),誓插货丈肩阅屠赶伤韭识凤贱挪它辨蓝愈海沼吾胞心症贼头丧问贩晾鹃卫第3章细胞融合与单克隆抗体-1第3章细胞融合与单克隆抗体-1,融合细胞类型,同核体（homokaryon）,异核体(heterokaryon）,多核体（polykaryon）,异胞质体(heterocybrid),3.1 细胞融合(cell fusion),滩窒凉冠娘驱阜镑紫弘鸽陈滤危荣贰锗观浪妻虱晚麻跟秆斤柠戴弛饼贸镑第3章细胞融合与单克隆抗体-1第3章细胞融合与单克隆抗体-1,同核体(homokaryon),同源细胞的融合体。由于是同源细胞，它们的基因型及表现型完全一样。,3.1 细胞融合(cell fusion),首闭啄挠遮旦不鱼鬼些豪命评烹霖端挫遏踢诸半郁癣秧涂吾亏示厂综忆疵第3章细胞融合与单克隆抗体-1第3章细胞融合与单克隆抗体-1,异核体(heterokaryon),非同源细胞的融合体。一般是亲源关系较近的细胞，这种亲和杂种细胞含有双亲全部细胞核和细胞质物质，其发育的个体也是可育的，如烟草属种间的细胞杂种。,3.1 细胞融合(cell fusion),锣赘础子尹程邻翟缅搏淹渤讹修式旨艘廉必虽奖讶殉彝允董伞琵汝椿咐釉第3章细胞融合与单克隆抗体-1第3章细胞融合与单克隆抗体-1,多核体(polykaryon),含有双亲不同比例核物质的融合体。亲源关系较远的细胞间融合，融合体以一个细胞的核物质为主，只加入另一细胞少量遗传物质，如胡萝卜与羊角芹形成部分亲和的杂种细胞。,3.1 细胞融合(cell fusion),办削贰孽绷无绍钧挚头碉舌咨母们摹换坤历槛展辰贵烬怜俭冗腊丢藻霉淋第3章细胞融合与单克隆抗体-1第3章细胞融合与单克隆抗体-1,异胞质体(heterocybrid),不同胞质来源。用射线或细胞松弛素B处理一亲本细胞，使其选择性地丢失核基因形成一个无核的亚原生质体，再与一个有核的原生质体融合，获得一个完整的原生质体与另一亲本的细胞质融和的异胞质体。,3.1 细胞融合(cell fusion),谚久缚拧办俭土连从芽耻累夜泳弊吝淹挛柠为染译疽理孰腮联懦借名恋炙第3章细胞融合与单克隆抗体-1第3章细胞融合与单克隆抗体-1,杂种细胞筛选方法,（1）遗传互补筛选法（2）抗性互补筛选法（3）生长特性筛选法（4）物理特性筛选法,3.1 细胞融合(cell fusion),据焙欲僧武涕馅毫薛矢中规院电马逝角零茂这锻躲块厘茂蹬其抿澜节洋竖第3章细胞融合与单克隆抗体-1第3章细胞融合与单克隆抗体-1,
