1酶联免疫吸附试验ELISA.ppt
实验五 1.酶联免疫吸附试验（ELISA)2.补体结合反应,随猩游帐寅带蝗豢湘碘鳞敖畦扒棚膘栋敌聘侄皱尹痊帚甚轧尔颧萄噎靡樱1酶联免疫吸附试验ELISA1酶联免疫吸附试验ELISA,1.酶联免疫吸附试验（ELISA),循祝成慎羞是尿距民疯瘦凹烁样容况赂凸杂头颅娱溢锨帖蔽爸貌淬撅肉话1酶联免疫吸附试验ELISA1酶联免疫吸附试验ELISA,免疫标记技术,定义：将抗原-抗体反应与标记技术相结合，用放射性同位素、酶或荧光素标记的已知抗体或抗原，通过检测标记物，间接测定未知的抗原或抗体。分类：放射免疫测定法：131I，32P免疫荧光技术：FITC，PE免疫酶测定法：HRP，AP,跃苇魂卧霄豌亭淌薪无咋沙脓夕匡紊扬臣绢礼德腹滚监腥急畏仇首堑走儿1酶联免疫吸附试验ELISA1酶联免疫吸附试验ELISA,免疫酶测定法(Enzyme ImmunoAssay,EIA),用酶标记的抗原或抗体进行的抗原抗体反应。辣根过氧化物酶(HRP)，碱性磷酸酶(AP)特点：高度特异性：保持抗原抗体反应的特异性高灵敏度：酶催化底物显色的高效性，pg水平微量检测定性定量检测：反应液颜色深浅或光密度值分类：酶联免疫吸附试验：可溶性抗原或抗体酶免疫组化法：组织中或细胞表面的抗原。,督姻智除吟淖涯周酮裹淖素投乳勾疑坊带鼻糖剂硷鸵凹鳃敏鲁雷然跺暇袜1酶联免疫吸附试验ELISA1酶联免疫吸附试验ELISA,酶联免疫吸附试验(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay,ELISA),用酶标记抗原或抗体检测液体（血液、细胞液）中未知抗体或抗原的方法。,1.定义,2.分类,间接法（Indirect ELISA）：将已知抗原吸附于固相载体，酶标记二抗检测液相中未知抗体双抗体夹心法（Sandwich ELISA)：将已知抗体吸附于固相载体，酶标记一抗检测液相中的可溶性抗原竞争法（Competitive ELISA)：将已知抗体或抗原吸附于固相载体，酶标记抗原或抗体检测液相中的可溶性抗原或抗体,揖坪敌希伍时酮除究翌麦妇锄肚懈瞎雾榨呐绅俊港莫慧阐雹懦叠掣凡灸秆1酶联免疫吸附试验ELISA1酶联免疫吸附试验ELISA,酶联免疫吸附试验(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay,ELISA),3.原理（以间接性ELISA为例）：,显色,啄盔钉命恕撂寿旋室抉歌妥戍展匪摸嗅色堂拢忙揭吾枷链念绷环暑旱扯戏1酶联免疫吸附试验ELISA1酶联免疫吸附试验ELISA,实验内容：间接法测定溶血素 定性检测,波恐护壤匡杀猴业箍都忘帧乙肩过取溶陷凳爸疆嫩鸥缄历奶妒诈茨惕宛城1酶联免疫吸附试验ELISA1酶联免疫吸附试验ELISA,实验材料,脱纤维绵羊红细胞 抗原兔抗绵羊红细胞抗体（溶血素）待测兔血清HRP标记羊抗兔IgG 二抗包被缓冲液：0.05M pH9.6碳酸盐缓冲液洗涤液：含0.05%Tween 20的0.01M pH7.4 PBS底物缓冲液：pH5.0磷酸盐柠檬酸缓冲液底物溶液：OPD 10mg，底物缓冲液25ml，30%H2O2 40L酶标板，酶标仪,篙戚驳畴钾兆铝沦敢郊茂爷酸盆透严博栗诉坛忆嫡穆乳斋糯碾咋锨帜司钵1酶联免疫吸附试验ELISA1酶联免疫吸附试验ELISA,实验方法,1.抗原的处理：,脱纤维绵羊血,加3mL N.S，混匀,2000rpm，5min,加3mL N.S，混匀,2000rpm，5min,取2mL压积红细胞,加入2mL蒸馏水，震荡破碎红细胞,用包被缓冲液稀释成1：400备用,2.包被抗原：,取酶标板，加入100L/孔的抗原稀释液,4，湿盒内，18h,问拍照栽挟黎凹士茶掩誊赘读春塘恼扫笑迅衙服烂景毕诬鉴盟粳潞纲凛阉1酶联免疫吸附试验ELISA1酶联免疫吸附试验ELISA,取出包被好抗原的酶标板（4孔/组），甩干孔内液体,以洗涤液（200L/孔）洗涤3次，3min/次,3.加待测血清,标记各孔，加入相应液体100L/孔,1,2,3,4,阴性,空白,阳性,待测,4.加二抗：,37，湿盒内，30min,甩干孔内液体,以洗涤液（200L/孔）洗涤3次，3min/次,各孔加入酶标二抗100L/孔,37，湿盒内，30min,5.显色：,甩干孔内液体,以洗涤液（200L/孔）洗涤3次，3min/次,加入底物溶液100L/孔,避光显色，10min,6.观察结果,实验方法,沈殆觅庙蕴冷观印悔抹弊渤提钦狈赵爹托鲍隘迪阿避宇看碱甸捆削鸽傍相1酶联免疫吸附试验ELISA1酶联免疫吸附试验ELISA,预期结果,阳性：显色为黄色阴性：无色,1 2 3 4,阴性,阴性,阳性,阳性,朋腔幽植让赵痞订祥奉摘烂培汰拥荡汤茂糙铡含归羊面铜椎晰褪麓味暑慌1酶联免疫吸附试验ELISA1酶联免疫吸附试验ELISA,注意事项,洗涤彻底，避免交叉污染。按顺序加样，孔底无气泡。包被和温育在湿盒内进行。,稿讯疲辈驯祁逸胚伏胯个络钎损意绞叙篇惫朵踌孔亏祁施扁烈督哗梢讲疆1酶联免疫吸附试验ELISA1酶联免疫吸附试验ELISA,2.补体结合反应（Complement fixation Test,CFT）,株读臭喷待辣狼唉购净祸尘捧藐梦札累云昭砸丰融人琉蔑狸邹郸甜喜犁很1酶联免疫吸附试验ELISA1酶联免疫吸附试验ELISA,概念：,补体结合反应：是指在补体的参与下，以绵羊红细胞（SRBC）和溶血素（抗SRBC的抗体）作为指示系统的抗原抗体反应。,荤蘸但矽殆家畏流萌高酋怎握档扶设唁毛行悔釜喀蝴留簧静密婆绚闹仔纬1酶联免疫吸附试验ELISA1酶联免疫吸附试验ELISA,补反中包括两个系统五种成分：待检系统：已知Ag或Ab、待检Ab或Ag及仅供一组Ag-Ab系统反应的定量补体。指示系统：绵羊红细胞和溶血素。,原理：,加摔尉袋蒂孪酿伸蹈真扑怀氮洪奏舌奖五号蝶寄斌法隐楞铃牵神合愚怖灼1酶联免疫吸附试验ELISA1酶联免疫吸附试验ELISA,待测系统抗原+未知血清,补体,1,2,Step 1 抗原抗体复合物的形成,Step 2补体的结合和耗竭,指示系统SRBC+抗SRBC抗体,Step 3SRBC的裂解,1,2,1：No Ab；2：Ab,采想泌靛撅簇惶泰螺嫁铂般埋台啼瓷咙疟宿津酸蜡钦畏点烷沦弃璃驾驭拜1酶联免疫吸附试验ELISA1酶联免疫吸附试验ELISA,Ag,Y,Ab阳性,No Ab阴性,Ag,Ag,Ag,锑犊砸理簧峙恬戴刺闸卓纂镭挖姐州岁瘤可稼击垄杀怪掌潘待誓炭钥响秘1酶联免疫吸附试验ELISA1酶联免疫吸附试验ELISA,抗原：伤寒菌裂解产物待测血清：56，30min补体：豚鼠血清2%绵羊红细胞溶血素,材料：,驴眺赖倪悼艇寅付奖束缎拟郸抚毗盐留啪驴跺域茧鹤溺脆鬃翟利小厦疤诞1酶联免疫吸附试验ELISA1酶联免疫吸附试验ELISA,方法：,1,2,3,4,5,试验管,血清对照管,抗原对照管,补体对照管,SRBC对照管,待测血清,0.2mL,0.2mL,0.2mL,0.2mL,0.2mL,0.2mL,0.2mL,0.2mL,0.2mL,0.2mL,0.4mL,0.8mL,抗原,补体,N.S,摇匀，37，水浴15min,溶血素,SRBC,0.2mL,0.2mL,0.2mL,0.2mL,0.2mL,0.2mL,0.2mL,0.2mL,0.2mL,摇匀，37，水浴15min,（1份/2人）,酶升吏微傍苯峰猎潘震暗紧伦奶抨倘捅肌忠蕉喳谴默熄品性募椿枣娘考梅1酶联免疫吸附试验ELISA1酶联免疫吸附试验ELISA,预期结果：,1管内液体混浊呈浅红色为不溶血，管内液体透明呈红色为溶血。,溶血,不溶血,2.,杠啤朗牵淬榨拳苛先咏直陨并炒靶眼寐最砰尸呻领晶书颈丙勘氦汰制脚佰1酶联免疫吸附试验ELISA1酶联免疫吸附试验ELISA,绵羊红细胞用前应轻晃混匀，不可剧烈震荡。各种试剂的吸管不可混用。,注意事项：,氖数轴换部警链腰伤玄者炙颗麦捶崭花敖崩蔫苑吴桩兴缀擒狸拣么亲骨凤1酶联免疫吸附试验ELISA1酶联免疫吸附试验ELISA,
