实验巨噬细胞酸性磷酸酶显.ppt

实验八、巨噬细胞酸性磷酸酶显示,组织化学（histochemistry）和细胞化学（cytochemistry）,是在组织切片上或被检材料上，加一定试剂，使它与组织或细胞中待检物质发生化学反应成为有色沉淀物，以用光镜观察，若为重金属沉淀，可以用电镜观察，称电镜组织化学（electron microscope histochemistry)。这种方法可用于检测细胞内的酶类、糖类、脂类、核酸与某些金属元素等。如进一步应用显微分光光度计等测定标本中沉淀物的强度，则能较精确地进行定量研究。,1.糖类显示法,最常用的显示方法是过碘酸-雪夫反应（periodic acid Schiff，PAS反应)。基本原理是：糖被强氧化剂过碘酸（HIO4)氧化后，形成2-醛基；后者与Schiff试剂中的无色品红亚硫酸复合物结合，形成紫红色反应产物,PAS反应阳性部位即表示多糖的存在。,2.酶类显示,酶的显示法是通过显示酶的活性来表明酶的存在，而不是酶的本身。将具有酶活性的组织放人含有一定底物的溶液中孵育，底物经酶的作用形成初级反应产物，它再与某种捕捉剂相反应，形成显微镜下可视性沉淀，即最终反应产物。,3脂类显示,脂类物质包括脂肪与类脂。标本可用甲醛固定、冷冻切片、用油红、苏丹、苏丹、苏丹黑B、尼罗蓝等脂溶性染料染色；亦可用锇酸固定兼染色，脂类呈黑色。,4核酸显示法,显示DNA的传统方法为Feulgen反应。切片DNA经弱酸(1mol/LHcl)水解,其上的嘌呤碱和脱氧核糖之间的键打开,使脱氧核糖的一端形成游离的醛基,这些醛基在原位与Schiff试剂(无色品红亚硫酸钠溶液)反应,形成紫红色的化合物,使细胞内含有DNA的部位呈紫红色阳性反应.紫红色的产生,是由于反应产物的分子内含有醌基,醌基是发色团,因此具有颜色.如用甲基绿-派若宁反应，可同时显示细胞内的DNA和RNA。甲基绿与细胞核中的DNA结合呈蓝绿色，派若宁与核仁及胞质内的RNA结合呈红色。,酸性磷酸酶显示实验原理,酸性磷酸酶能分解磷酸脂（常用-甘油磷酸钠）而释放出磷酸基。在pH50的环境中，磷酸基能与铅盐（硝酸铅，捕捉剂）反应形成无色的磷酸铅（微细沉淀，可在电镜下观察），再经过与硫化铵作用，形成棕黑色的硫化铅沉淀（可在光镜下观察），以此显示酸性磷酸酶在细胞内的存在与分布。,实验材料：,小鼠腹腔液涂片（重点观察巨噬细胞）。,实验试剂及用品,1、6淀粉肉汤 牛肉膏 03g 蛋白胨 1.0g 氯化钠 05g 可溶性淀粉 6g 蒸馏水 100ml 高压灭菌99104pa(15磅)20min 2、10中性福尔马林(pH6871)甲醛 10ml 蒸馏水 90ml 醋酸钠 2g,3、酸性磷酸酶作用液 配方：蒸馏水 90ml 02molL醋酸缓冲液(pH46)12ml 5硝酸铅 2ml 3.2甘油磷酸钠 4ml 配法：先将蒸馏水和醋酸缓冲液混合，随后分成大致相等的两份，一份中加硝酸铅溶液，另一份加甘油磷酸钠溶液，然后再将两者缓缓混合，边混边搅匀。若pH不到50，可加少量醋酸的调整。注意：配好后的作用液应透明无絮状悬浮物和沉淀；最好在临用前配制，不能贮存。附：02molL醋酸缓冲液（pH46）配制方法 0.2mol/l醋酸（ml）25.5 0.2mol/l醋酸钠（ml）24.5,4、1硫化铵溶液 硫化胺 1ml 蒸馏水 9ml 5、姬姆萨染液（1：30）姬姆萨原液 3滴 磷酸盐缓冲液（pH68）5ml,实验方法,1、巨噬细胞诱导：实验前2天开始，每日向小鼠腹腔注射6淀粉肉汤1ml，连续注射3天。2、收集巨噬细胞：在第三天注射后34h，再向腹腔注射生理盐水1ml，过3min后抽取腹腔液。3、粘附：将腹腔液滴在预冷的载玻片上，每人2片，每片23滴，将玻片水平放到冰箱内（4），让细胞自行铺展、粘附30min。将其中1片样品置湿盒内放50温箱中30min，使酶失活4、固定：将玻片插入盛有10中性福尔马林（已预冷）的染色缸内，冰箱内4固定30min。5、自来水漂洗5min，将水甩干。,6、加足量酸性磷酸酶作用液覆盖样品，放37水浴箱中反应30min。7、自来水漂洗片刻。9、在通风橱中加硫化铵反应10min。10、自来水冲洗，甩干。11、直接加PBS封片（或用130的Giemsa染液染色15min再封片）。,12、镜检,阳性标本细胞质中，出现许多棕色或棕黑色的颗粒和斑块。,作业,1、比较对照标本与正常处理标本结果的不同2、比较吞噬活性强的大体积巨噬细胞和吞噬活性弱的小体积巨噬细胞酸性磷酸酶的分布与活性,