实验二植物体内硝酸还原酶活力的测定.ppt

实验二 植物体内硝酸还原酶活力的测定,植物生物学实验-植物生理部分,NO3-和NH4+是能被植物利用的最主要的氮源。在一般田间条件下，NO3-是植物吸收的主要形式。,硝酸盐的还原,硝酸盐,硝酸还原酶,亚硝酸盐,氨,亚硝酸还原酶,硝酸还原酶是一种诱导酶，在植物体内本来不含有，但在特定外来物质的如NO3-诱导下可以生成硝酸还原酶。,硝酸还原酶（NR）是植物氮素同化的关键酶，它催化植物体内的硝酸盐还原为亚硝酸盐：NO3-+NADH+H+NO2-+NAD+H2O 产生的亚硝酸盐与对-氨基苯磺酸（或对氨基苯磺酰胺）及-萘胺（或萘基乙烯胺）在酸性条件下定量生成红色偶氮化合物。,【实验原理】,生成的红色偶氮化合物在540nm有最大吸收峰，可用分光光度法测定。硝酸还原酶活性可由产生的亚硝态氮的量表示。一般以单位时间内每克鲜重含氮量表示，即以g/g/h为单位。NR的测定可分为活体法和离体法。活体法步骤简单，适合快速、多组测定。离体法复杂，但重复性较好。,小麦的新鲜叶片（诱导组和非诱导组）,【实验材料】,冷冻离心机；分光光度计；天平(0.01g)；冰箱；恒温水浴；研钵；剪刀；离心管；移液管(5、2、1mL)；洗耳球；试管架；(12)胶头滴管。,【实验器材】,标准曲线制作 取7支洁净烘干的15ml刻度试管按下表顺序加入试剂，配成0-0.20g/mL的系列标准亚硝态氮溶液。摇匀后在25下保温30min，然后在540nm下比色测定。以亚硝态氮浓度（g/mL）为横坐标（X），吸光值为纵坐标（r）建立回归方程。,【实验步骤】,酶的提取 称取0.5-1g 鲜样（诱导组和非诱导组分别进行），剪碎置冰箱冰冻30min，取出置研钵中，冰浴研磨成匀浆，转移入离心管中，洗研钵2-3次，将液体转入离心管中，共用提取液6 mL，4 8000rpm离心15min，上清液即为粗酶提取液。酶反应 取4个10 mL离心管，按照下表所列进行操作，混匀，25保温30min。,终止反应和比色测定 30min后立即加入l mL磺胺溶液终止酶反应，再加l mL萘基乙烯胺溶液，显色30min后于4000rpm离心5min，取上清液在540nm下比色测定。根据标准曲线计算出反应液中亚硝态氮浓度（g/mL）。,【结果计算】,样品中酶活性（g g-1h-1）=X 反应液酶催化产生的亚硝态氮浓度（g/mL）；V1提取酶时加入的提取缓冲液体积（mL）；V2酶反应时加入的粗酶液体积（mL）；V3与磺胺等发生颜色反应的总体积（mL）；W 样品质量（g）；t 反应时间（h）。,【注意事项】,硝酸还原酶容易失活，离体法测定时，操作应迅速，并且在4下进行。制作标准曲线时，从显色到比色时间尽可能保持一致，显色时间过长或过短对颜色都有影响。,【思考与作业】,比色测定前加入磺胺和萘基乙烯胺的顺序不能颠倒的原因是什么？,