实验二培养基的制备.ppt

实验二 培养基的制备,一、目的要求,1.掌握培养基制备的原则；2.掌握培养基的制备方法。,二、实验原理,1、培养基的概念？培养基是指由人工方法配合而成的营养基质，专供微生物培养、分离、鉴别、研究和保存菌种用的混合营养物制品。,2、必须具备五个条件:,含有细菌生长所需的物质：如：水分、养分（氮源、碳源、矿物质）等适宜的酸碱性：多数为，有的为pH5.6-6.8。不含抑制细菌生长的物质；均质透明：便于观察细菌生长性状和引起培养基的变化，严格灭菌，保证无菌。,配好立即高压灭菌，并保证新鲜。,3、培养基的分类,根据对培养基组成物质的化学成分是否完全了解来区分：,天然培养基合成培养基半合成培养基。,根据培养基的物理状态来区分：,固体培养基液体培养基半固体培养基,根据培养基的用途来区分：,增菌培养基选择培养基鉴别培养基,中国农业出版社陈天寿主编,一些物质在培养基中的应用原理,1.细菌生长的基础营养物质：N源：蛋白胨（peptone）、酵母浸出物 牛肉浸膏 C源 无机盐类 水,一些物质在培养基中的应用原理,2.具有抑菌作用的物质 抑制G-菌的：葡萄糖、亚硫酸铋和煌绿 抑制G+菌的：结晶紫、胆盐 抑制肠道非致病菌的：胆盐,一些物质在培养基中的应用原理,3.具有生化反应作用的硫羟代乙酸钠（硫乙醇酸钠）、半胱氨酸、葡萄糖、肝块、肉渣、还原铁等还原剂生化反应,一些物质在培养基中的应用原理,4.具有缓冲作用的 磷酸盐 碳酸盐,一些物质在培养基中的应用原理,5.具有PH指示作用的中性红指示液 变色范围 pH6.88.0（红黄）孔雀绿指示液 变色范围 pH0.02.0（黄绿）；11.013.5(绿无色)石蕊指示液 变色范围 pH4.58.0（红蓝）甲基红指示液 变色范围 pH4.26.3（红黄）刚果红指示液 变色范围 pH3.05.0（蓝红）亮绿指示液 变色范围 pH0.02.6（黄绿）结晶紫指示液 pH值0.15（黄）0.32（绿），pH值1.0（绿）1.5（蓝），pH值2.0（蓝）3.0（紫）。溴甲酚紫指示液变色范围 pH5.26.8（黄紫）溴麝香草酚蓝指示液 变色范围 pH6.07.6（黄蓝）,一些物质在培养基中的应用原理,6.其它 硫酸亚铁 色氨酸 脲酶,培养特性,（一）体外培养的要求 营养、温度、PH、气体、培养时间（二）培养性状 1.液体培养基 需氧菌：菌膜 兼性厌氧菌：均匀浑浊 厌氧菌：沉淀 2.固体培养基 菌落特点:大小、颜色、边缘、湿润程度 3.色素 脂溶性：菌体有颜色（如金黄色葡萄球菌）水溶性：菌体和培养基都有颜色（如绿脓杆菌）,4、培养基制备的基本方法,培养基配方的选定培养基的制备记录培养基成分的称取培养基各成份的混合和溶化培养基pH的调正培养基的过滤培养基的分装培养基的灭菌培养基的质量测试培养基的保存,同一种培养基的配方在不同文献中常存在某些差别。因此应尽量收集有关资料，加以比较核对，再依据自己的使用目的，加以选用，记录其来源。,4、培养基制备的基本方法,培养基配方的选定培养基的制备记录培养基成分的称取培养基各成份的混合和溶化培养基pH的调正培养基的过滤培养基的分装培养基的灭菌培养基的质量测试培养基的保存,每次制备培养基均应有记录:包括名称、配方及其来源、pH值、消毒的温度和时间、制备的日期和制备者等，以防发生混乱。,4、培养基制备的基本方法,培养基配方的选定培养基的制备记录培养基成分的称取培养基各成份的混合和溶化培养基pH的调正培养基的过滤培养基的分装培养基的灭菌培养基的质量测试培养基的保存,必须精确称取，并注意防止错乱。可将配方置于傍侧，每称好一种成分即在配方上做出记号,最后还应进行一次检查。,4、培养基制备的基本方法,培养基配方的选定培养基的制备记录培养基成分的称取培养基各成份的混合和溶化培养基pH的调正培养基的过滤培养基的分装培养基的灭菌培养基的质量测试培养基的保存,可先用温水加热并随时搅动、以防焦化。待大部分固体成分溶化后，再用较小火力使所有成分完全溶化，直至煮沸。在加热溶化过程中，因蒸发而丢失的水分，最后必须加以补足。,4、培养基制备的基本方法,培养基配方的选定培养基的制备记录培养基成分的称取培养基各成份的混合和溶化培养基pH的调正培养基的过滤培养基的分装培养基的灭菌培养基的质量测试培养基的保存,经加热煮沸，培养基各成分完全溶解,待冷却接近室温时,应进行pH的调正。,4、培养基制备的基本方法,培养基配方的选定培养基的制备记录培养基成分的称取培养基各成份的混合和溶化培养基pH的调正培养基的过滤培养基的分装培养基的灭菌培养基的质量测试培养基的保存,培养基必须均质透明。通常采用过滤以达到此项要求。一般液体培养基可用滤纸过滤法。,4、培养基制备的基本方法,培养基配方的选定培养基的制备记录培养基成分的称取培养基各成份的混合和溶化培养基pH的调正培养基的过滤培养基的分装培养基的灭菌培养基的质量测试培养基的保存,应按使用的目的和要求，分装于适当容器内。分装量一般超过容器装盛量的2/3。,4、培养基制备的基本方法,培养基配方的选定培养基的制备记录培养基成分的称取培养基各成份的混合和溶化培养基pH的调正培养基的过滤培养基的分装培养基的灭菌培养基的质量测试培养基的保存,一般采用高压蒸汽灭菌方法（121，15min）。某些畏热成分，如糖类、血清等，一般以过滤方法除菌，以后再用无菌操作技术、定量加于培养基。,4、培养基制备的基本方法,培养基配方的选定培养基的制备记录培养基成分的称取培养基各成份的混合和溶化培养基pH的调正培养基的过滤培养基的分装培养基的灭菌培养基的质量测试培养基的保存,灭菌以后，应仔细检查，如发现破裂、水分浸入、色泽异常等、均应挑出弃去。将全部培养基放入37 恒温箱培养过夜，如发现有细菌生长，即弃去。用已知菌株接种部分培养基,培养2448h。如无菌生长或生长不良，应追查原因并重复接种一次，如结果仍同前，则该批培养基即应弃去。,4、培养基制备的基本方法,培养基配方的选定培养基的制备记录培养基成分的称取培养基各成份的混合和溶化培养基pH的调正培养基的过滤培养基的分装培养基的灭菌培养基的质量测试培养基的保存,应存放于冷暗处，最好放于普通冰箱内；平板培养基不宜超过3天；必须附有明显标签。,三、实验材料,量杯（1000mL和500mL各1个）、玻璃棒、漏斗、三角瓶、试管、玻璃瓶（500mL）等；pH试纸、纱布、脱脂棉、滤纸、包装纸、扎线等；牛肉膏、蛋白胨、氯化钠、磷酸氢二钾、琼脂、葡萄糖、牛肉渣、蜡块、蒸馏水、l mo1/L NaOH溶液和1 mo1/L HCl溶液等。,四、实验内容,普通肉汤的制备：,（1）常用配方:,牛肉浸膏 3-5g蛋白胨 10g氯化钠 5g磷酸氢二钾 0.5g蒸馏水1000mL,四、实验内容,普通肉汤的制备：,（2）配制方法:,取水600700mL，加热；按照配方称取各物品加入水中，边加热边搅拌，快沸时注意不要溢出，沸腾后停止加热；冷却至室温；用pH试纸测定pH并调至7.2-7.6。若pH7.6，则用0.1mo1/L HCl调低;若pH7.2，则用0.1mol/L NaOH调高.调好pH值后，补足水量至1000mL，再测pH值。,四、实验内容,厌氧肉汤的制备：,配制方法:,取制备好的普通肉汤5mL，装于试管中，加入牛肉渣、蜡块少许即可。,四、实验内容,普通琼脂的制备：,普通肉汤 1000mL琼脂 20g,取普通肉汤 400mL于500mL瓶中;加入优质琼脂8g;盖好瓶塞，并用纱布扎口。,配方:,配制方法:,琼脂的凝胶化温度一般在3540,而凝胶熔点应在7585,常见凝固剂有琼脂、明胶、无机硅胶等,四、实验内容,高压灭菌,将所有要高压的物品整齐的摆放在高压灭菌锅内；盖好压力盖，关闭放气孔，接通电源；压力达到0.05MPa时，关闭电源缓慢放气至压力为0，接通电源；再重复放气1次；维持121,15-20min,操作方法:,六、思考题,制备细菌培养基的要求？制备培养基制作的一般步骤？在你制作的培养基中接种细菌，细菌不能生长，分析其原因。,演示内容,血培养基制备。抗凝血无菌的采集；浇注平板。要领：叠浇、铺满但要薄；斜面的制作：高度1/5，斜面1/2；半固体：1/3（0.3-0.5%）液体：1/4 TSI:底层厚厌氧培养基的制备及原理。,1.取水500mL，加热；2.按照配方称取各物品加入水中，边加热边搅拌，快沸时注意不要溢出，沸腾后停止加热；冷却至室温；牛肉浸膏 3.75g蛋白胨 7.5g氯化钠 3.75g磷酸氢二钾 0.375g补足水量至750mL3.用pH试纸测定pH并调至7.2-7.6。若pH7.6，则用0.1mo1/L HCl调低;若pH7.2，则用0.1mol/L NaOH调高.4.调好pH值后，各自再补足水量，再测pH值。将6支做厌氧培养基（共约30ml），200ml装入小盐水瓶；取20ml再配0.4%琼脂的半固体培养基6支；余下500ml加2%（10g琼脂）继续加热至充分融化，固体培养基中倒6支斜面，其余加入盐水瓶。,今天实验内容/每组：,