实验三硝酸还原酶活性测定.ppt

实验3 硝酸盐和光诱导对硝酸还原酶（NR）活性的影响,硝酸还原酶,植物从土壤中吸收的NO3必须经代谢性还原才能被利用，因为细胞组分中的N均呈高度还原态，而NO3中的N为高度氧化态。硝酸盐的还原由硝酸还原酶(nitrate reductase,NR)催化。硝酸还原酶存在于细胞液中，为一种诱导酶。诱导酶(induced enzyme):植物体本来不含有，但在特定外来物质(如底物)的诱导下,可以产生的酶。,受光促进,1.实验目的意义,掌握硝酸还原酶活性的测定方法了解硝酸还原酶的特性,硝酸还原酶（，缩写NR）是硝酸盐同化中第一个酶，也是限速酶，处于植物氮代谢的关键位置。它与植物吸收利用氮肥有关，对农作物产量和品质有重要影响，因而硝酸还原酶活性被当作植物营养或农田施肥的指标之一，也可作为品种选育的指标之一。,硝酸还原酶可将NO3-还原成NO2-，其反应为：,NO3-+NADH+H+NO2-+NAD+H2O,在一定条件下，NO2-的生成量与NR的活性呈正相关，因此，可以通过测定NO2-的生成量来代表NR的活性。,2.实验原理,NO2-含量测定（磺胺比色法）,在酸性溶液中，NO2-与磺胺形成重氮盐，重氮盐再与-萘胺偶联，形成紫红色的偶氮化合物。该偶氮化合物在540nm有最大吸收峰，可以用分光光度计测定（OD540）。,（！不稳定，见光容易分解，测定需迅速。）,当磺胺与-萘胺均过量时，所生成的红色深浅与NO2-含量成直线关系。NO2-含量标准曲线：NO2-(mol/ml)=0.00260.359OD540,NR活性(NO2-,mol/hgfw)=,鲜重(g)时间(h),NO2-(mol/ml)稀释倍数,离体法：将材料磨成匀浆，经过滤或离心除去残渣，以上清液为硝酸还原酶粗酶液进行测定。缺点：由于研磨中NADH受损失，必需外加NADH方可测定。活体法：直接用鲜活组织进行测定。环境中的NO3-进入细胞后被NR还原成NO2-，并扩散到细胞外在溶液中积累，测定溶液中NO2-的含量即可得知NR的大小。优点：不破坏细胞原有的酶反应系统，NADH可由代谢反应不断生成，无需外加。简便、快速，不需要贵重仪器设备及低温条件。缺点:重复性欠佳，应作一定量的重复。,硝酸还原酶活性测定,3.材料与试剂,两种处理的小麦：水(ck)，KNO3（N）A液：磷酸缓冲液:水:DNP溶液:蔗糖溶液 5:5:1:1B液：磷酸缓冲液:KNO3:DNP溶液:蔗糖溶液 5:5:1:1 磷酸缓冲液(pH7.5):0.2mol/L；KNO3溶液:0.2mol/L DNP(2-4-二硝基苯酚)溶液:1mmol/L；蔗糖溶液:2.5mmol/L磺胺试剂-萘胺试剂,取样前一天，用50mM KNO3加到培养小麦的水中，光照，以诱导硝酸还原酶产生。两种材料水(ck)，KNO3(N)各取2份新鲜叶片中段，用蒸馏水洗净、擦干，剪成1cm小段，称取0.3克；将4份（ck、N）叶段分别置于含有10ml A、B溶液的两只试管中，即ckA、ckB、NA和NB四管；用纱网将材料压于液面以下，将试管放在真空干燥器中抽气30分钟，放气后摇晃直至叶段沉于溶液中；将试管置于2530温箱中，黑暗保温30分钟；立即吸取1ml反应液，加入2ml磺胺试剂，摇匀，再加入2ml-萘胺试剂（注意顺序），用漩涡仪混合摇匀，25 水浴（水浴锅）反应5分钟,取出后桌面静置10分钟，随后5分钟内，在540nm测定样品的吸光值（以蒸馏水为对照）。取A液和B液1ml代替反应液，加入2ml磺胺试剂和2ml-萘胺试剂，作为对照管，在540nm测定样品的吸光值（以蒸馏水为对照）。,4.实验步骤,5.结果与分析,分析硝酸盐对硝酸还原酶活性的影响。,6.注意事项,抽真空放气后，摇晃直至叶段沉于溶液中；硝酸还原过程应在黑暗中进行；磺胺试剂和-萘胺试剂加入时，注意顺序；正确使用分光光度计；避免移液管使用交叉感染。,1）为何提前一天施KNO3，并且取样应在晴天进行？2）NR酶活性（NO2-，uMol/hgfw）=NO2-10ml/1ml（鲜重g0.5h）公式中的0.5 h 指哪一个？,7.思考题,酶反应要在暗条件下进行的原因是叶绿体在光合作用时可产生亚硝酸还原酶的辅酶铁氧还蛋白，与亚硝酸还原酶同时存在时可还原NO2-，所以在暗条件下进行反应可阻止NO2-的继续反应，以保证测定结果的准确。,