外源基因的表达.ppt

第七章 外源基因的表达,第一节 外源基因在原核细胞中的表达,1.原核生物基因表达的特点,与真核细胞相比，原核细胞的基因表达有以下特点：（1）原核生物只有一种RNA聚合酶（真核细胞有三种）识别 原核细胞的启动子，催化所有RNA的合成。（2）原核生物的基因表达是以操纵子为单位的。（3）由于原核生物无核膜，所以转录与翻译是偶联的，也是连续进行的。（4）原核基因一般不含有内含子，在原核细胞中缺乏真核细胞的转录后加工系统。（5）原核生物基因的控制主要在转录水平，这种控制要比对,基因产物的直接控制要慢。（6）在大肠杆菌mRNA的核糖体结合位点上，含有一个转译起始密码子及16S核糖体RNA 3 末端碱基互补的序列，即S-D序列，而真核基因则缺乏此序列。,2.原核表达系统的注意事项,从上述特点可以看出，欲将外源基因在原核细胞中表达，必须考虑表达载体、外源基因的性质、原核细胞的启动子和S-D序列、阅读框架及宿主菌调控系统等基本条件，也就是说必须满足以下条件：（1）通过表达载体将外源基因导入宿主菌，并指导宿主菌的酶系统合成外源蛋白。（2）外源基因不能带有内含子，因而必须用cDNA或化学合成,的基因，而不能用基因组DNA。（3）必须利用原核细胞的强启动子和S-D序列等调控元件控制外源基的表达。（4）外源基因与表达载体连接后，必须形成正确的开放阅读框架。（5）利用宿主菌的调控系统，调节外源基因的表达，防止外源基因的表达产物对宿主菌的伤害。,3.原核生物基因表达的调控序列,只有在了解了原核生物基因表达调控序列的基础上，才能够构建高效的表达载体，使外源目的基因在原核细胞中得到高效率、高水平地表达。对于原核细胞来讲，基因表达的调控序,列主要涉及启动子、S-D序列、终止子、增强子、衰减子等序列。（1）启动子 启动子(promoter)是DNA链上一段能与RNA聚合酶结合并能起始mRNA合成的序列，它是基因表达不可缺少的重要调控序列。没有启动子，基因就不能转录。原核生物的启动子是由两段彼此分开且高度保守的核苷酸序列组成。-35区（TTGACA）：位于转录起始位点上游的-35bp附近，是RNA聚合酶初始识别和结合位点。-10区（Pribnow框，TATAAT）：RNA聚合酶结合于此处导致DNA双链形成单链。,原核表达系统中通常使用的可调控的强启动子有lac（乳糖启动子）、trp（色氨酸启动子）、PL及PR（噬菌体左向和右向启动子）、tac（乳糖和色氨酸的杂合启动子）等。（2）终止子 在一个基因或一个操纵子的3端往往有一个特定的核苷酸序列，它有终止转录的功能，这一段DNA序列称为终止子（terminator)。终止子在结构上有一些共同的特点，即有一段富含A/T的区域和一段富含G/C的区域，G/C区域具有回文对称结构，使转录后的RNA具有茎环结构。根据转录终止作用类型，终止子可分为两种：依赖于因子的转录终止子及不依赖于因子的转录终止子。,（3）S-D序列 S-D序列是位于起始密码子（AUG）上游310bp处的由39bp组成的序列。这段序列正好与16S rRNA 3端序列互补，是rRNA的识别和结合位点。S-D序列存在与否及S-D序列与起始密码子之间的距离，是影响mRNA翻译成蛋白质的主要因素之一。（4）增强子 增强子（enhancer)是能够增强启动子转录活性的DNA顺式作用序列。,4.几种类型的原核表达载体,在原核细胞中表达外源基因时，由于实验设计的不同，总的来说可以产生融合型和非融合型表达蛋白。不与细菌的任何蛋白或多肽融合在一起的表达蛋白称为非融合蛋白。融合蛋白指蛋白质的N末端由原核DNA序列或其它DNA序列编码，C端由真核DNA的完整序列编码。（1）非融合型表达蛋白载体pKK223-3具有一个强的tac（trp-lac）启动子，这个启动子是由trp启动子的-35区、lac UV5启动子的-10区、操纵基因及S-D序列组成。紧接着tac启动子的是一个取自pUC8的多位点接头，使之很容易把目的基因定位在启动子和S-D序列之后。,在多位点下游的一段DNA序列中，还包含一个很强的rrnB核糖体RNA的转录终止子。载体的其余部分由pBR322组成。（2）分泌型克隆表达载体pIN III系统 这个载体系统是由pBR322为基础构建的。带有大肠杆菌最强的启动子之一，即Ipp（脂蛋白基因）启动子。在启动子的下游装有lac UV5的启动子及其操纵基因，并把lac阻遏子的基因（lac I）也克隆到这个质粒上。这样目的基因的表达就成为可调节的了。在转录控制的下游再装上人工合成的高效翻译起始序列（S-D序列及ATG）。信号肽序列取自于大肠杆菌中分泌蛋白的基因ompa（外膜蛋白基因）。,在编码序列的下游紧接着一段人工合成的多克隆位点片断，包括三个单一酶切位点，Eco RI、Hind III、Bam HI。（3）融合蛋白表达载体pGEX系统 载体的组成成分基本上与其它表达载体相似，含有启动子tac及lac操纵基因、S-D序列、lacI阻遏蛋白基因等。这类载体与其它表达载体不同之处在于S-D序列下游是谷胱甘肽巯基转移酶基因，而克隆的外源基因则与谷胱甘肽巯基转移酶基因相连。当进行基因表达时，表达产物为谷胱甘肽巯基转移酶和目的基因产物的融合蛋白。,5.外源基因在大肠杆菌中的表达部位,（1）不同表达部位 克隆在大肠杆菌中的外源基因，它们的编码产物蛋白质，有的是在细胞质中表达，有的是在细胞周质中表达，还有的则是以分泌到细胞外的方式表达。细胞质中表达 大肠杆菌细胞质中表达的外源蛋白，大多是以包含体的形式存在的。包含体是存在于细胞质中的一种由不溶性蛋白质聚集折叠而成的晶体结构。周质中表达 周质是指在大肠杆菌一类格兰氏阴性细菌中，位于内膜和外膜之间的细胞结构部分。周质中表达的蛋白需要在信号肽的引,导下才能穿越内膜，进入细胞周质。细胞外表达 表达的外源蛋白分泌到胞外培养基中，同样需要信号肽序列的引导。（2）不同部位表达外源蛋白的优缺点,表7.1 不同部位表达外源蛋白的优缺点,6.影响外源基因表达效率的因素及提高表达水平常用的方法,（1）启动子结构对表达效率的影响 原核生物启动子有两种保守序列，即-35区的TTGACA序列和-10区的TATAAT序列。研究发现，启动子的强度与一致序列的相似程度成正比。进一步的研究表明，-35和-10区的距离也是一个重要因素。如果间隔为17个碱基对，启动子表现很强，如果大于17个碱基对，启动子表现较弱。根据这些原理，Amann等克隆了tac启动子（lac-trp），促进了克隆基因的表达。（2）转译起始序列对表达效率的影响,S-D序列的保守性、S-D序列后面的4个碱基成分以及起始密码子AUG左侧的密码三联体的碱基组成都会影响到外源基因的表达效率。如：UAAGGAGG比GGAGG高36倍（表达水平)SD与AUG间富含AT有利于翻译 AUG左侧的密码三联体为UAU或CUU时，转译最为有效；如果是UUC、UCA或AGG时，转译水平将下降20倍。（3）启动子同克隆基因间的距离对表达效率的影响 启动子同克隆基因间的距离对表达效率的影响，主要是由于mRNA的5末端形成不同的二级结构，从而影响mRNA的翻译效率。根据上述原理，要提高克隆基因的表达效率，可采用构建克,隆库的办法。在库中，将外源基因分别放置在离启动子远近不同的地方。转化后，筛选重组克隆，从中筛选出外源基因表达最强的克隆。（4）转录终止区对克隆基因表达效率的影响 克隆基因的末端是否存在转录终止区也会影响到克隆基因的表达效率。其原因可能为：若干非必须的转录本的合成，会使细胞消耗巨大的能量用于制造大量非必须的蛋白质。在转录本上有可能出现一些不期望出现的二级结构，从而降低了转译的效率。偶尔会出现启动子阻塞现象。因此，在构建表达载体时，在克隆基因后面安装一个强转录,终止子（如rrnB 终止子）对完全终止转录是必要的，可以阻止通读，增加基因表达。（5）质粒的拷贝数及稳定性对表达效率的影响 由于细胞中的核糖体数量，与任何一种mRNA分子数目相比，都是大大超量的，因此，提高克隆基因表达效率的途径之一，是增加相应的mRNA分子数量。为此，须增加质粒的拷贝数及其稳定性。一般采用松弛型质粒构建外源基因的表达载体，从而达到增加质粒及外源基因拷贝数的目的。质粒载体中含有分配功能区par，能保证质粒分子在每次细胞周期中都能准确地进行分离，并均等地分配到子代细胞中去，从而达到稳定质粒拷贝数的作用。,（6）mRNA的稳定性对表达效率的影响 原核生物的mRNA分子的降解速度很快，一般在几秒几分之间。因此，维持外源基因mRNA的稳定性可提高其表达效率。一般的作法是给外源基因mRNA的5及3端安装某些结构序列，保护mRNA不能被降解。如：3端茎环结构、转录终止子结构；E.coli ompA转录物的5非翻译部分可作为mRNA的稳定剂。（7）遗传密码子的使用对表达效率的影响 无论是真核基因还是原核基因，一种特定的氨基酸并不是以等同的频率使用所有的同义密码子，而是使用其中的某一两种。我们将这种遗传密码子使用的非随机性现象，称为密码子使用偏爱性，简称密码子偏爱性。,选择和使用大肠杆菌偏爱密码子有利于增加外源基因在大肠杆菌中的翻译效率，从而提高外源基因的表达效率。（8）寄主细胞的生理状态对基因表达效率的影响 大肠肝菌寄主细胞的生理状态，会或多或少地影响外源基因的表达效率，诸如：培养基营养成分的选择、细胞培养的方式，以及培养的温度和培养基中所溶解的氧的数量等环境参数。不过，有关处于不同生理状态下的大肠杆菌寄主细胞，究竟是怎样影响外源基因的细胞效率的，人们在这方面的知识还是相当贫乏的。,图7.1 原核细胞的启动子序列,图7.2 原核基因转录的起始,图7.3 原核基因终止子序列及其结构,图7.4 非融合型表达蛋白载体pKK223-3,图7.5 分泌型克隆表达载体pIN III系统,图7.6 融合蛋白表达载体pGEX系统,图7.7 4个天然启动子和两个人造启动子的-35区和-10区的碱基序列,图7.8 三个重组质粒的cro mRNA二级结构,图7.9 改变Lac 启动子和克隆基因间距离的一般方法,第二节 外源基因在真核细胞中的表达,1.酵母表达系统,酵母（yeast）是一类以芽殖或裂殖进行无性繁殖的单细胞真核生物，是最理想的真核生物基因表达系统。（1）酵母表达系统的优点基因表达调控的机制比较清楚，遗传操作相对简便。具有原核生物所不具备的蛋白质翻译后的加工和修饰系统。可将外源基因表达产物分泌到培养基中。对人体和环境安全，不含毒素和特异性病毒。可进行大规模的发酵，工艺简单而成熟，成本低廉。,（2）酵母基因表达载体 酵母克隆和表达载体是由酵母野生型质粒、原核生物质粒载体上的功能基因（如抗性基因、复制子等）和宿主染色体DNA上的自主复制子结构（ARS）、中心粒序列（CEN）、端粒序列（LEL）等一起构建而成。酵母基因表达系统的载体一般是一种穿梭质粒，它既能够在原核细胞（大肠杆菌）中复制，又能在真核细胞（酵母）中复制。DNA复制起始区a：大肠杆菌源质粒的复制起始序列：使其能在大肠杆菌中复制。b：酵母菌的天然2质粒的复制起始序列或酵母基因组中的自主复制序列，使其能在酵母菌中复制。,选择标记基因a：营养缺陷型选择标记，宿主菌为相应的营养缺陷型。b：显性选择标记（G418等），可采用各种类型酵母细胞作为宿主细胞。有丝分裂稳定区 来源于酵母染色体着丝粒（centromere）片断，能保证表达载体在酵母细胞分裂时，能平均地分配到子代细胞中去。表达盒 表达盒是酵母表达载体的重要元件，包括启动子、分泌信号肽序列、多克隆位点及终止子序列。启动子：保证转录的起始。分泌信号肽序列：引导目的基因蛋白分泌到细胞外。,多克隆位点：供外源基因插入。终止子：保证转录在适当位置停止。（3）酵母基因表达载体的种类自主复制型质粒载体 该质粒含有酵母基因组的DNA复制起始区、选择标记、基因克隆位点等关键元件。酵母基因组DNA复制起始区：能够在酵母细胞中自主复制。基因克隆位点：来源于大肠杆菌源质粒，如pBR322。这类载体的优点在于：在酵母细胞中的转化率高，每个细胞拷贝数可达200个缺点在于：由于缺乏酵母染色体着丝粒片断，在细胞分裂过程中不能均匀的分配到子细胞中去，因而经过多代培养后，子细,胞中质粒载体的拷贝数迅速减少。整合型质粒载体 该质粒载体不含有酵母DNA复制起始区，不能在酵母中进行自主复制，但该质粒含有整合介导区，可以通过DNA的同源重组将外源基因整合到酵母染色体上，随染色体一起进行复制。着丝粒型质粒载体 该质粒载体是在自主复制型质粒载体的基础上构建而成的，增加了酵母染色体有丝分裂稳定序列元件（着丝粒），因而能保证质粒载体在细胞分裂时平均地分配到子细胞中去，同时提高了质粒在宿主细胞中的稳定性。酵母人工染色体,（4）酵母基因表达系统宿主菌 目前，作为外源基因表达的宿主酵母菌主要包括：酿酒酵母、巴斯德毕赤酵母、乳酸克努维酵母和多形汉森酵母。（5）在酵母中高效表达外源基因的策略提高表达载体在细胞中的拷贝数 以多拷贝酵母内源性质粒为基础构建的多拷贝表达载体，是提高表达载体在酵母中拷贝数的一个途径。但以上的多拷贝载体在没有选择压力的情况下，可能难以保持其高拷贝数。将外源基因整合到染色体上可维持外源基因在细胞中的稳定性，然而在多数情况下会因为在细胞中的拷贝数较低而影响其表达。,提高外源基因的转录水平 在构建表达载体时组入强启动子，如：酵母磷酸甘油酯激酶基因启动子、甘油醛磷酸脱氢酶基因启动子，可提高外源基因的转录水平。但外源基因表达的产物量过高也会对细胞形成伤害。选择合适的受体细胞系统 根据表达载体特性，选择合适的酵母受体系统。,2.植物细胞基因表达系统,（1）植物基因表达载体的组成特性 大多数植物基因表达载体是以Ti质粒为基础构建而成的，其组成包括启动子、T-DNA、终止子、内含子及选择标记基因和报告基因。植物基因表达载体的启动子 根据启动子的功能和作用方式，可分为组成型启动子、诱导型启动子和组织特异性启动子等几类。组成型启动子：外源基因的表达大体恒定在一定水平，在不同组织部位没有明显差异，没有时空特异性。一般采用花椰菜花叶病病毒（CaMV）35S RNA的启动子、Ti质粒的胭脂碱合成酶基因(nos)或章鱼碱合成酶基因(ocs)的启动子。,诱导型启动子：在某些特定的物理或化学信号刺激下，可大幅度提高外源基因的转录水平。组织特异型启动子：外源基因只能在特定的组织细胞中表达。如：采用马铃薯块茎蛋白基因的启动子、花粉特异表达基因启动子等。植物基因表达载体的终止子 不同来源的终止子对外源基因的表达有很大影响，它不仅决定外源基因的转录活性，也决定mRNA在细胞中的稳定性，从而影响mRNA的翻译。研究表明，采用相同的启动子及外源基因，而采用不同的终止子序列，外源基因的表达水平有很大差异（差异可达60倍）。T-DNA（transfer DNA）,可将外源基因连入T-DNA区域，随T-DNA随机整合进入植物细胞的染色体基因组中，从而使外源基因得到稳定维持和表达。但必须注意保留T-DNA序列的左右边界序列，因为左右边界序列是外源DNA转移和整合不可缺少的元件。内含子序列 研究表明，内含子与基因表达水平有很大关系。因而在构建植物基因表达载体时，可根据不同基因的类型，有选择性的插入内含子序列。选择标记基因和报告基因 选择标记基因和报告基因的作用在于筛选转化体，检测外源基因的转译水平。常用的选择标基因有新霉素磷酸转移酶基因、二氢叶酸还原酶基因、潮霉素磷酸转移酶基因等；报告基因有冠瘿碱基因、氯霉素乙酰转移酶基因等。,（2）植物基因表达的受体系统 植物基因表达的受体系统是指用于转化的植物细胞，主要包括以下五类：愈伤组织再生系统 它是外植体经脱分化培养、诱导愈伤组织并通过分化培养获得再生植株的受体系统。特点：易于接受外源基因，转化效率高；扩繁量大，可获得大量的转化植株；但获得的再生植株无性系变异较大；外源基因的稳定性差。直接分化再生系统 它是指外植体细胞不经脱分化阶段而直接分化出不定芽而获得再生株。,特点：获得再生植株的周期短，细胞无性系变异小，能较好地保持受体细胞的遗传稳定性；但转化率相对较低，存在较多的嵌合株。原生质体再生系统 特点：转化率高，可形成基因型一致的细胞克隆；但原生质体培养周期较长、难度大、再生频率较低，在原生质体的培养过程中易造成变异。胚状体再生系统 它是指体细胞或单倍体细胞在组织培养条件下诱导成为形态结构和功能上类似于有性胚的胚状体，是一种最理想的转化受体系统。特点：转化率高；获得嵌合体少；可生产人工种子。,生殖细胞受体系统 以生殖细胞如花粉、卵细胞等作为基因转化的受体细胞，通过组织培养技术将生殖细胞诱导成为胚性细胞或愈伤组织，或直接利用花粉和卵子受精过程进行基因转化。特点：转化率高；易于获得稳定的遗传，并且通过加倍后成为纯合的二倍体。（3）提高外源基因在植物细胞中的表达效率的策略构建高效表达的转化载体防止外源基因失活优化先导序列，提高翻译效率,3.哺乳动物细胞基因表达系统,（1）哺乳动物基因表达载体的组成特性 哺乳动物基因表达载体一般包括：在哺乳动物细胞中进行基因转录的元件，即转录的启动子、终止子、poly(A)信号和内含子剪接信号。启动子：主要来源于病毒，如：SV40的早期和晚期转录启动子、腺病毒晚期启动子等。也可选用某些真核基因的启动子，如：鼠细胞的金属硫蛋白基因启动子（可达到诱导表达的目的）等。终止子和poly（A）：常用的poly（A）及终止子信号来自SV40。,内含子剪接信号：如果采用cDNA，没有内含子，因而也不需要相应的内含子序列。如果采用基因组DNA，需要内含子剪接信号将相应的内含子去除。剪接点之间的距离及剪接点周围的序列会影响到剪接效果。同时，基因中组入一个合适的内含子有时会提高外源基因的表达水平。用于筛选转化子的选择标记基因 一般采用胸苷激酶基因（tk）、二氢叶酸还原酶基因、氨基糖苷磷酸转移酶基因等作为哺乳动物转化细胞的筛选标记基因。在细菌中进行复制和筛选的元件 使表达载体能够在原核细胞中进行大量复制，经筛选获得阳性克隆子，后者经大量培养可提取出大量含外源基因的表达载体，最后用于转化或转导哺乳动物受体细胞。,基因表达的调控元件 如：增强子可提高外源基因的转录水平，而衰减子的作用恰恰相反，降低了外源基因的转录水平。（2）哺乳动物基因表达载体不带真核复制起始序列的质粒型载体 该类载体只含原核复制子，质粒载体被转移到哺乳动物细胞后不能以附加体的形式复制，而是被整合到宿主细胞的基因组中，并在基因组的调控下以较低的水平进行表达。这类载体如：pTK2、pHyg、pRSVneo等。带真核病毒调控序列元件的质粒表达载体 目前构建的大多数哺乳动物表达载体都带有来源于不同病毒基因组的复制起始序列，这些病毒基因表达调控元件能有效地,调节外源基因在哺乳动物细胞中的表达。这类表达载体如：SV40衍生的表达载体、人疱疹病毒衍生的表达载体、人腺病毒衍生的表达载体及反转录病毒衍生的表达载体。（3）哺乳动物基因表达宿主细胞 选择的基本原则：来源丰富、转化效率高、表达效果好。因此，能在培养基中无限生长的哺乳动物细胞常被用作基因表达的宿主细胞。哺乳动物的正常细胞具有表面接触抑制作用，只有肿瘤组织的永生性细胞系才能表现为无限生长，而且生长速度快，但肿瘤组织的生理特征与正常细胞存在很大差异。因此，在哺乳动物基因表达过程中，与正常细胞生理特征尽可能接近的肿瘤细胞常被选择为基因转移的受体细胞。,正常的东北虎皮肤成纤维细胞（处于接触抑制状态）,人肺癌上皮样细胞,目前，用作哺乳动物基因表达系统的受体细胞包括：CHO-K1细胞（中国仓鼠卵巢上皮细胞）、COS细胞（猴肾细胞）、鼠骨髓瘤细胞等。此外，为了采用体细胞克隆的方法构建转基因动物，采用体外诱导永生化的细胞作为受体细胞，如采用紫外线适度照射、一些诱变剂适度处理，但结果均不理想。（4）提高哺乳动物基因表达系统表达效率的策略改进表达载体、提高外源基因表达水平和产量 采用哺乳动物内源性的强启动子可使外源基因获得高水平表达。此外，提高外源基因在宿主细胞中的拷贝数也是提高表达水平的一种方法。为此，在构建基因表达载体时可考虑将载体构建成一种自我复制型载体，载体以附加体的形式在宿主细胞内自主复制；另一种方法是将外源基因与选择标记基因的表达,结合在一起，当细胞在选择压力下培养时，两种基因产物都能获得高效表达。抑制宿主细胞凋亡 细胞凋亡是一种由遗传基因决定的程序性细胞死亡。体外培养的细胞可采用如下方法抑制细胞凋亡，为细胞生长提供足够的营养和氧源；加入抗氧化剂延缓细胞凋亡；将抗细胞凋亡基因导入宿主细胞；体外处理使细胞成为永生化细胞。,