外源化合物致癌作用.ppt

第八章外源化学物致癌作用,Chemical carcinogenesis,近三十年以来，癌症发病数以年均3-5%的速度递增；3/4新增病例发生在新兴工业国家及发展中国家；癌症已成为人类第二位死因，超过艾滋病、结核、疟疾致死病例的总和；WHO要求各会员国制定国家癌症防控规划，指出“If youre not planning,youre planning to fail”Dr.John R.Seffrin,癌症已成为一个全球性公共健康问题,全球癌症状况,2008 年,(IARC报告)全球恶性肿瘤新发病例1270万（2002-1090万）死亡病例760万（670)带瘤生存患者2460万,发病率最高：肺癌、乳腺癌和大肠癌死亡率最高：肺癌、胃癌和肝癌患病率最高：乳腺癌,年，的新确诊癌症病人和的死亡病例来自发展中国家,预计2030 年,1320万人死于癌症,确诊癌症病人将有大约2140万,我国改革开放以来，经济、社会、环境和生活方式发生了快速变化人口结构快速向老龄化转变在这一特定历史时期，中国癌谱将呈现特征性变化,中国癌症现状（1）,全国老龄工作委员会:2013年底，全国60岁以上的老年人口将达到2亿，占人口总数的14.8%，今后每年将增加约1000万老年人口，预计到2053年达到4.87亿人。,IARC 报告:2008年282万（2012-220万）新发病例196(2002-160)万死亡病例,中国癌症现状（2）,肿瘤发生过程是宿主与环境之间发生复杂的、动态的相互作用过程重要的宿主因素：遗传构成、健康状况主要的环境因素：食物、环境污染、职业和生活方式一般估计，80%-90%的人类肿瘤与环境有关，其中主要是化学因素,肿瘤是可以预防的,要降低肿瘤的发病率，首先必须识别、鉴定化学致癌因素和有害的生活方式，阐明其作用机理，然后采取措施加以防治研究化学物致癌作用具有非常重要意义,目的要求,掌握致癌作用概念并了解其机制熟悉致癌化学物分类熟悉致癌作用评价方法,第一节 化学致癌过程,Mechanisms of chemical carcinogegesis,毒理学中“癌”肿瘤,Tumor：指有分裂潜能的细胞受到致癌因素作用后发生恶性转化和克隆性增生所形成的新生物。,上皮细胞恶性病变-癌间质细胞恶性病变-肉瘤良性肿瘤,12,生理特征,细胞周期失控具有迁移性接触抑制丧失 定着依赖性丧失 去分化现象 对生长因子需要量降低，代谢旺盛蛋白质合成及分解代谢都增强 线粒体功能障碍,化学致癌物（chemical carcinogen）:具有致癌作用的化学物质化学致癌作用（chemical carcinogensis）:化学物质引起或诱导正常细胞发生恶性转化并发展成为肿瘤的过程,英国的烟囟清扫工,阴囊癌,多环芳烃化合物（3,4苯并芘、）,（进展）,多因素、多基因参与的多阶段过程,q-长臂；p短臂,正常细胞必须通过肿瘤相关基因遗传改变的积累才能形成癌细胞,APC、DCC、p53-抑癌基因，Ras-癌基因,20s世纪40年代，Rous、Mottram和Bernblum等分别试验i亚致癌剂量的多环芳烃，皮肤涂抹，（DMBA:二羟甲基丁酸）P巴豆油（其中有促长作用的有效成分为佛波醇酯（TPA）,肿瘤发生是一个长期的、多阶段、多基因改变累积的过程，具有多基因控制和多因素调节的复杂性。化学致癌过程至少可分为:引发（initiation）促长（promotion）进展（progression）,细胞癌变的多阶段学说,1.引发阶段（Initiation)。,2.促长阶段（Promotion),3.进展阶段（Progression),DNA损伤,损伤固定遗传性状改变,突变细胞在内、外因素的作用下，促进肿瘤细胞的分裂和增生,突变细胞,生长速度快侵袭性和转移能力强生理生化和免疫性状改变,1、引发阶段引发（启动）是遗传毒性发生的过程，是化学致癌的第一步。致癌物直接作用于DNA，引起基因突变，使单个或少量细胞发生永久性的、不可逆的遗传性改变，成为突变细胞，或称“启动细胞”，诱发细胞突变的因素称为引发剂（启动剂）。启动细胞的表型可能正常，它必须通过克隆扩增才能形成良性损伤。在接触致癌物与发生细胞转化之间要有一个相当长的潜伏期，需要启动效应的遗传传递。,引发阶段的主要特征不可逆 需要通过细胞分裂加以固定 剂量-反应显示没有可测定的阈值，无可测定的最大反应 存在自发的引发作用 对外源性化学物质和其他化学因素敏感 引发作用必须发生在促长作用之前，“纯”引发作用在无促长时不导致肿瘤,2、促长阶段细胞在致癌物的作用下变成启动细胞后，在某些因素作用下，以相对于周围正常细胞的选择优势进行克隆扩增，形成镜下或肉眼可见的细胞群，即良性肿瘤（如乳头状瘤或腺瘤）。促长价段癌细胞的表型发生变化，恶性肿瘤细胞的各种性状得以表达。起促进作用的因素称为促长剂或促癌剂。促癌剂包括多种人类环境中存在的因子，如TCDD、苯巴比妥，以及高盐高脂饮食、糖精、香烟烟雾等。其中烟雾既是肺癌、胰腺癌、食道癌和其它器官癌的启动剂，同时也是促癌剂。人体内的一些内源性物质也具有促癌作用，如雌激素对乳腺癌有促进作用；胆酸是结肠癌与肝癌的促进剂。,促癌剂的作用机理：通过细胞毒性或激素作用刺激细胞增殖。如高脂肪饮食可使乳腺癌的发病率增高，原因是高脂肪饮食可使催乳素分泌增多，而催乳素对乳腺癌的发生有促进作用。抑制细胞间的信息互通，从而解除细胞生长的接触抑制，使启动了的细胞能逃脱周围正常细胞的抑制，出现增殖失控。免疫抑制。,促长阶段的主要特征可逆性 促长剂通常是非致突变物，需要持续和 反复暴露促长剂的有效性仅出现在引发作用之后促长细胞群的存在取决于促长剂的持续存在内源性促长剂可起自发促长作用剂量-反应显示有可测定的阈值，有可测 定的最大效应对饮食和激素等因素敏感促长作用的相对效力取决于达到最大效 应的时间和剂量速率,3、进展阶段 指在肿瘤形成过程中，在促进之中或之后，细胞表现出不可逆的遗传学改变，其标志为遗传不稳定性增加和恶性变化，在形态上或功能代谢和行为方面逐渐表现出恶性肿瘤的生物学特征，如生长速度、侵袭性、转移能力、以及生理生化、免疫性能的改变等。当细胞开始失去维持核型稳定的能力并出现染色体畸变时，它们即进入进展期。核型不稳定性进一步促进肿瘤细胞的生长和恶性表型的发展，同时引起细胞代谢调节功能的改变，且逃避机体免疫监视等功能。,进展阶段的主要特征不可逆伴随生长率和侵袭性的增加出现核型异常，核型不稳定性导致细胞基因组结构的形态学改变有可测定的和/或形态学可描述的细胞基因组的改变进展的早期阶段对环境因素敏感可见良性和/或恶性肿瘤促展剂可促进细胞进入该阶段，但可能不是引发剂可以发生自发的进展作用,第二节 化学致癌机制,化学致癌作用：多因素、多基因参与的多阶段过程。遗传机制学派（genetic theory）：亲电子剂学说、体细胞突变学说、癌基因学说、癌变的阶段学说 表观遗传机制学派（epigenetic theory）,化学物致癌机理：(1)亲电子剂学说(2)染色体异常学说(3)癌基因学说(4)细胞异常增生、免疫抑制(5)癌变的表遗传学机制(6)癌变的阶段学说,指非基因序列改变所致基因表达水平变化:DNA甲基化/组蛋白修饰/染色质重塑/非编码RNA,突变,代 谢 酶,须在体内代谢活化（母体化合物）,a.直接致癌物b.间接致癌物的活化代谢产物,前致癌物 近致癌物 终致癌物,主要 解毒物,终致癌物亲电子代谢物,1971年Miller提出直接致癌物（direct carcinogen）间接致癌物终致癌物(ultimate carcinogen),亲电剂与生物大分子（如DNA）亲核物结合形成加合物DNA损伤部分细胞恶性转化肿瘤,致癌物多数具有遗传毒性，具有遗传毒性的致癌物尽管化学结构和性质不尽相同，但有一共同特点：均为亲电子剂。,依据：1.大多数致癌物同时也是致突变物2.许多致癌物的致突变和致癌性质取决于它们是否转变为亲电子的代谢物3.DNA加合物的水平通常与致癌性和致突变性成正相关4.DNA和致癌物的相互作用可活化肿瘤基因,DNA加合物可作为人类接触环境致癌物的生物标记物,DNA加合物是引起肿瘤的直接原因之一,对DNA损伤而引起肿瘤的遗传毒性机制 对DNA以外靶分子作用的非遗传毒性机制,从本质上说，肿瘤是一种遗传物质改变导致的疾病，即“遗传病”大多数环境因素的致癌作用都是通过影响遗传基因作用的，肿瘤是细胞中多种基因突变累积的结果。,1920年Roreri提出恶性肿瘤细胞起源于一个染色体不平衡的细胞,一个世纪前,两位德国科学家发现,染色体紊乱可能是癌症的直接成因,但这一发现没有得到应有的关注,因为科学界的主流观点认为,基因突变才是引起癌症的真正原因,染色体紊乱只是癌症发生的结果。随着检测技术的进步,越来越多的发现和证据与主流理论背道而驰。,致癌剂的实际作用是导致非整倍化 染色体的改变方式只与长出肿瘤的组织有关,而与患者没有太大的关系。这就是说,某一组织的细胞要发生癌变,染色体必须发生一定的改变,才能使细胞摆脱遗传程序的束缚。因此,非整倍体细胞要走上恶变之路,染色体变异就是最基本的条件。,致癌物质会随机地造成染色体的损伤和有丝分裂的故障，受此影响的分裂细胞就会无法平均分配染色体，使两个子细胞都变成非整倍体细胞。,大多数非整倍体细胞都不能存活，但存活下来的细胞继续分裂。轻度非整倍体细胞及其子代细胞会逐步丧失正常功能，但还没有导致大量增值。,细胞内染色体数目异常造成了更多染色体损伤和混乱，于是每一代子细胞越加不稳定，并逐步发展出恶性细胞的特征。,癌基因,20世纪60年代初,很多著名科学家都认为,病毒是引发绝大多数肿瘤的罪魁祸首。当时发现,一些病毒感染细胞后,会将自身的遗传物质插入细胞的基因组,引起细胞的恶性转化和异常增殖,最终导致白血病等癌症。逆转录病毒的研究对于阐明人类癌症的发生机理具有重要意义。逆转录病毒的基因组中除了病毒本身复制所必需的基因，如编码病毒核心蛋白（gag）、外壳糖蛋白（env）及逆转录酶（pol）等的基因外，还包括一个能引起细胞恶性转化的基因。这种基因就是现在为人们所熟知的癌基因（oncogene，onc）。由于最初是在病毒中发现的，所以称之为病毒癌基因（v-onc）。后来发现，在许多动物的正常细胞中都存在着与 v-onc 相对应的DNA序列，称之为原癌基因（protooncogene）或细胞癌基因（c-onc),原癌基因,癌基因,突变,致癌物,癌变,原癌基因与癌基因关系,“原癌基因”(proto-oncogene）就像一颗颗“定时炸弹”,埋藏在人类基因组里,随时可能爆发，一旦发生突变,原癌基因就会变成癌基因,1.细胞癌基因在长期进化过程中极为保守，在无脊椎动物（如果蝇）的基因组中就可以找到与哺乳动物细胞癌基因基本上同源的序列。所以实际上在正常情况下，细胞癌基因不仅对机体无害，而且可能在发育过程中，以至于对生命的维持起着重大的作用2.细胞癌基因在正常细胞中可以有低水平的表达，而在癌组织中与其相对应的活化癌基因的表达水平却比它高的多。,现有资料表明：,抑癌基因（anti-oncogene）,又称肿瘤抑制基因（tumor suppressor gene），指对细胞生长、增殖和分化起负性调节的基因,抑癌基因失活肿瘤细胞增殖失控正常情况抑癌基因具有多种多样的细胞功能，如P53,野生型抑癌基因的功能是使正常细胞以及肿瘤细胞分化避免增值过多（减少增值和/或诱导分化和增加凋亡）,遗传毒性致癌物主要通过原癌基因突变从而激活为癌基因或/和抑癌基因突变从而失活引起致癌作用癌基因的两个等位基因中的单个基因突变可以影响细胞表型抑癌基因的两个等位基因都必须失活才能改变细胞表型,（原癌基因）,癌基因、抑癌基因与生长因子的关系,癌基因,抑癌基因,细胞,生长因子,正调控,负调控,产物,终末分化,增 殖,化学致癌过程,完全致癌物：兼有引发、促长和进展作用的化学物,外来化学物,与人体接触,大多数经代谢解毒,排 泄,非遗传毒性化合物,直接致癌物,少数经代谢活化,终致癌物,直接或间接诱导有丝分裂、促进细胞过度增殖,作用于大分子,DNA损伤修复,DNA加合物形成、癌基因与抑癌基因的改变,引发细胞,逃避细胞免疫监视,促癌物,癌前病变,肿瘤,多阶段致癌理论图解,化学致癌多基因、多因素参与的多阶段理论,化学致癌物,外源性因素 理化生物因素、营养等,内源性因素遗传、免疫、激素、精神等,生物体,引起癌基因、抑癌基因等发生点突变、扩增、易位、重排、缺失等使癌基因活化，抑癌基因失活，导致细胞的增殖、分化、凋亡异常引起肿瘤,第三节 化学致癌相关的分子事件,端粒调控与细胞永生化细胞调控周期紊乱细胞凋亡与肿瘤发生,第四节 化学致癌物分类,IRAC分类 按化学致癌作用模式和机制分类 按对人和动物致癌性的其它分类,人类致癌动物致癌 证据 证据1组（致癌物）充分2组（A可疑致癌物）有限 充分（B可能致癌物）有限 不充分 不足 充分3组（目前无法分类）不足 不足4组（可能是非致癌物）没有 没有,根据致癌物对人类和动物的致癌性分类（国际癌症研究中心 IARC，至2012年1月共评价927种）,组1，对人类是致癌物。对人类致癌性证据充分。有107种；组2，对人类是很可能或可能致癌物。组2A，对人类很可能是致癌物。对人类致癌性证据有限，对动物致癌性证据充分。有58种；组2B，对人类是可能致癌物。对人类致癌性证据有限，对动物致癌性证据并不充分；或对人类致癌性证据不足，对动物致癌性证据充分。有249种；组3，现有证据不能对人类致癌性分类。有512种；组4，对人类可能是非致癌物，有1种（己内酰胺）。,遗传毒性致癌物,化学致癌作用模式直接致癌物：不经过代谢活化就具有活性间接致癌物：必须经过代谢活化才具有致癌性 促癌剂：本身不致癌，但对致癌物有促进作用物质,表观遗传毒性致癌物,促癌剂、细胞毒物、激素、免疫抑制剂、固态物质,暂未确定遗传毒性的致癌物,（表观）,第六节 化学致癌物筛查的基本方法,化学致癌物判断的证据,1.人群流行病学调查：必须具备两项以上由不同研究者在不同地点、不同对象中以不同调查方法获得的结论相符的证据2.动物实验证据：至少有两项按现行常规设计进行，符合GLP，在不同物种动物所得结果一致的动物致癌物鉴定资料,基本方法,定量构效关系分析：特定结构、空间构象生物学效应（生物信息学）短期试验快速筛查 致突变试验、细胞转化试验、哺乳动物短期致癌试验哺乳动物长期致癌试验人群流行病学调查,一、短期试验,（一）致突变试验：基因突变试验：Ames试验.染色体畸变试验：体外细胞系细胞遗传学分析，小鼠骨 髓微核试验，大鼠骨髓染色体畸变试验;原发性DNA损伤：DNA加合物，链断裂，DNA修复诱导(细菌SOS反应，大鼠肝UDS诱导)，SCE试验；体外细胞转化：叙利亚地鼠胚胎细胞，Balb/c 3T3细胞,（二）细胞转化试验,受试物与正常细胞在体外接触，如有致癌作用，可使正常细胞形态、功能发生变化，发生与癌细胞相似的过程恶性转化后的细胞接种在裸鼠皮下可形成肉眼可见的肿瘤可以弥补致突变试验的不足：可检测遗传毒和非遗传毒致癌物,（三）哺乳动物短期致癌试验 哺乳动物短期致癌试验又称为有限体内试验，指时间有限(数月)，靶器官有限。较受重视的短期致癌试验有下列四种：1小鼠皮肤肿瘤诱发试验：引发剂为致癌性多环芳烃，促长剂为佛波醇酯(TPA)。2小鼠肺瘤诱发试验：引发剂为乌拉坦，促长剂为二丁基经基甲苯(BHT)。3大鼠肝转化灶诱发试验:引发剂为二乙基亚硝胺(DEN)，促长剂为苯巴比妥(PB)4雌性大鼠乳腺癌诱发试验 此四个试验不是成组试验，应根据受试物的特点选择使用。此四个试验任一试验得到阳性结果的意义与长期动物致癌试验相似，但阴性结果并不能排除受试物的致癌性。,适用于按照构效关系能预测靶器官的受试物,何时应考虑进行致癌性评价：,人体可能长期暴露于该化学物；该化学物或其代谢物的化学结构与已知致癌物相似；反复染毒毒性试验提示该化学物可能产生癌前病变。如在3种遗传毒理学短期试验均得到阳性结果，可预测为遗传毒性致癌物；如在3种遗传毒理学短期试验均得到阴性结果，可预测为非遗传毒性非致癌物；如经5种遗传毒理学短期试验仍不能预测其致癌性的化学品，应优先进行哺乳动物致癌试验。,二、哺乳动物长期致癌试验,期限：长期或终生 大鼠2年 小鼠1.5年,动物：敏感动物（两种）刚断乳或断乳不久雌雄各半每组每性别50只，希望在第1个肿瘤出现时，每组还有不少于25只动物,剂量：3个染毒组 无作用剂量组 阈剂量组 发生肿瘤剂量组1个对照组1个溶剂组（必要时）,结果观察、分析与评定,肿瘤总发生率()(实验结束时患肿瘤动物总数/有效动物总数)100,有效动物总数指最早发现肿瘤时存活动物总数,致癌试验常用指标：1.肿瘤发生率：最重要指标2.多发性：一个动物出现多个肿瘤或一个器官出现多个肿瘤3.潜伏期：通常用各组第一个肿瘤出现时间为该组潜伏期,肿瘤总发生率、恶性肿瘤总发生率、各器官或组织肿瘤发生率和恶性肿瘤发生率，各病理类型肿瘤发生率,应着重报告发现肿瘤的部位、数量、性质、癌前病变，以及其他毒性效应；应报告剂量反应关系及统计学分析结果。同时重视染毒组出现而对照组未出现的肿瘤类型如在动物组织中观察到良性和恶性肿瘤，并有良性肿瘤向恶性化进展的证据，在进行统计学分析之前将良性和恶性肿瘤合并是适宜的，但仍希望分别对良性和恶性分别统计处理。评价该试验不同剂量良性和恶性肿瘤的相对数量可有助于确定该受试动物对受试物的剂量反应关系。另一方面，如果仅观察到良性肿瘤，并无恶性化进展的证据，则将此受试物认为是致癌物是不适宜的，此仅提示在该试验条件下需要进一步研究。,结果报告：,三、人群流行病学调查,（一）接触标记（二）生物效应标记（三）敏感性标记,确定人类致癌物的唯一方法观察指标多是化学致癌作用的结果，对三早及预防不利,1转癌基因小鼠 与转录启动子连接的癌基因转入后可直接在某些特定的组织中高效表达，使该组织细胞处于引发状态，这类转基因动物是研究化学物致癌作用的敏感体系。携带癌基因的转基因动物可用于致癌试验，试验周期仅3个月左右，有希望发展成代替长期动物致癌试验的试验系统。这些携带有癌基因的转基因动物，可用来研究外源化学物与肿瘤相关基因的作用及外源化学物在致癌不同阶段中的作用机制。以各种组织特异性的促长剂处理转入不同癌基因的小鼠，可为致癌过程的研究提供新线索。,四、转基因小鼠在致癌作用的研究,2肿瘤抑制基因敲除小鼠 在P53-/-小鼠，肿瘤(特别是淋巴肉瘤)的发生比正常小鼠(P53+/+)增加而且提前。由于P53-/-小鼠的肿瘤发生具有组织特异性，进一步研究这些肿瘤的遗传学基础有助于鉴定P53基因的功能。而杂合子小鼠(P53+/-)在出生后6个月内自发癌发生率低，但在之后发生淋巴瘤和软组织肉瘤，其中大部分丢失P53野生型等位基因。这种小鼠对遗传毒性致癌物敏感性并不增加。这种半合子小鼠也可用于鉴定致癌过程中的协作基因。而且缺P53小鼠加速形成恶性肿瘤，提示此基因主要在进展阶段起作用。P53在肿瘤发生中的作用有待进一步研究。,3转穿梭质粒的转基因动物小鼠：转入带有报告基因的穿梭载体，是研究体内基因突变的转基因动物模型。常用的靶基因如lacI、lacZ可通过噬菌体体外包装等方法，从小鼠基因组内回收，再在大肠杆菌内检测靶基因突变，可为研究不同器官基因的自发突变和诱发突变的分子机制提供有效的方法。,WHO判定致癌试验的阳性标准：1.对照组也出现的肿瘤，试验组发生率增加2.试验组出现对照组没有的肿瘤3.试验组肿瘤发生早于对照组4.与对照组比，试验组动物的平均肿瘤数增加,复习,化学致癌作用、癌基因、抑癌基因、前致癌物、近致癌物、终致癌物、直接致癌物、间接致癌物举例说明肿瘤发生四多阶段多基因参与的过程致癌物的分类，IARC分类法基于哪些研究证据要判断一化学物是否具有致癌性，如何设计试验？转基因动物应用前景,