基因工程的常规技术.ppt
第三节 基因工程的常规技术,杂交技术,PCR技术,凝胶电泳技术,基因文库构建,一 凝胶电泳技术,凝胶电泳：用琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶等作为介质的区带电泳法称为凝胶电泳技术。,凝胶电泳的原理：分离原理-在电场的作用下，DNA分子在琼脂糖凝胶中移动时，有电荷效应和分子筛效应。检测原理-溴化乙锭（EB）在紫外光照射下能发射荧光，当用EB对DNA样品染色时，加入的EB就插入DNA分子中，荧光强度与DNA含量成正比。,影响琼脂糖凝胶电泳的因素：,DNA片段的大小凝胶的类型凝胶的浓度电泳缓冲液电压,琼脂糖凝胶电泳装置：,琼脂糖凝胶电泳装置：,凝胶成像分析系统：,DNA电泳图谱,RNA电泳图谱,重组子：2.7 kb+4.0 kb,非重组子：2.7 kb,4.0 kb,2.7 kb,5.4 kb,L1 L2,4.0 kb,P,H,聚丙烯酰胺凝胶电泳装置及其原理示意图,SDS-PAGE电泳图谱,1975，Edwen Southern提出分子印迹概念。概念：将存在于凝胶中的生物大分子转移（印迹）于固定化介质上并加以检测分析的技术。目前主要应用于DNA，RNA，蛋白质的检测。,二 杂交技术,核酸分子杂交的基本原理：,具有互补序列两条单链核酸分子在一定条件下按碱基互补配对原则退火形成双链的过程。杂交的双方是待测核酸和已知核酸序列，已知核酸序列称探针。,DNA印迹技术,Southern blotting 基因组DNA经限制性内切酶消化后，进行琼脂糖凝胶电泳，将含有DNA片断的凝胶放入变性溶液变性后，将硝酸纤维膜(NC)膜放在胶上，上面放吸水纸巾，利用毛吸作用使胶DNA转移质NC膜上，然后利用杂交技术检测NC膜上的DNA片断。,Southern Blotting:Gel Transfer,Southern blot,RNA印迹技术,Northern blotting 与Southern blotting相似，但不需要限制性内切酶切割。用于基因表达的特异性分析和定量分析。,酵母转化子Northern杂交结果,蛋白质免疫印迹法,Western blotting:免疫印迹法是检测蛋白质混合溶液中某种特定目的蛋白质的定性方法，也可以作为确定同一蛋白质在不同细胞或者同一种细胞不同条件下的相对含量的半定量方法。由于其检测往往需要抗体，所以也被称为免疫印迹技术。,应用 1 检测样品中特异蛋白存在与否 2 细胞中特异蛋白的半定量分析 3 蛋白质分子相互作用的研究,原理：蛋白质组分经SDS-PAGE分离后，平行转移到固相支持体（NC膜或PVDF膜）上，通过免疫试剂来检测靶蛋白。靶蛋白的检测通常采用两步法或间接法，用一抗结合靶蛋白，再用过氧化物酶（HRP）标记的二抗结合一抗，然后HRP催化化学显色反应或化学发光反应。,三 PCR技术,PCR技术的创建,Kary B.Mullis（穆利斯（美）,Khorana(1971)等提出在体外经DNA变性,与适当引物杂交,再用DNA聚合酶延伸,克隆DNA的设想。1983年,Mullis发明了PCR技术,使Khorana的设想得到实现。1988年Saiki等将耐热DNA聚合酶（Taq）引入了PCR技术 1989年美国Science杂志列PCR 为十余项重大科学发明之首,比喻1989年为PCR爆炸年,Mullis荣获1993年度诺贝尔化学奖。,Kary B.Mullis（1944）,http:/,PCR技术的基本原理,无细胞分子克隆法：在微量离心管中,加入适量的缓冲液,微量的模板DNA,四种脱氧单核苷酸,耐热性多聚酶,一对合成DNA的引物,通过高温变性、低温退火和中温延伸三个阶段为一个循环,每一次循环使特异区段的基因拷贝数放大一倍,一般样品是经过30次循环,最终使基因放大了数百万倍;扩增了特异区段的DNA带。,PCR扩增原理,引物,延伸,延伸,5,5,3,3,变性、退火,变性、退火,Polymerase Chain Reaction(PCR),引物设计：（1)序列应位于高度保守区,与非扩增区无同源序列。（2）引物长度以15-30 bp为宜（17 1.51010bp）。（3）碱基尽可能随机分布,G+C占50-60%。（4）引物内部避免形成二级结构。（5）两引物间避免有互补序列。（6）引物3端为关键碱基；5端无严格限制。,总体积 50-100 l Buffer 缓冲液 dNTP 原料 Primer 引物（0.1-0.5 mol/L）DNA分子 模板（50-100ng）Taq酶 DNA聚合酶（0.5-2.5 U/50 L）,反应体系：,经典循环参数：,94 30s 55 45s72 1min,94 5min,30次,72 7min,4,用途广泛：,生命学科医学工程遗传工程疾病诊断法医学考古学,四 基因文库构建,基因文库的基本概念,基因文库的构建程序,基因组文库重组克隆的排序,基因文库（gene library）,从特定生物个体中分离的全部基因，这些基因以克隆的形式存在（人工构建）。根据构建方法的不同，基因文库分为：,基因组文库（含有全部基因）,cDNA文库（含有全部蛋白质编码的结构基因）,基因文库构建的基本战略,用cDNA法构建cDNA文库，材料来自mRNA,在高度分化的生物体中，不同组织和细胞在不同时段的mRNA种类不同（即基因的表达谱不同），因此同种生物体的cDNA文库一般还有组织细胞的界定，如肝组织cDNA文库或胚胎组织cDNA文库等。,用鸟枪法构建基因组文库，材料来自染色体DNA,基因文库的构建程序,基因组DNA的制备,为了最大限度地保证基因在克隆过程中的完整性，用于基因组文库构建的DNA在分离纯化操作中应尽量避免过度的断裂。制备的DNA分子量越大，经切割处理后样品中含有不规则末端的DNA片段的比率就越低，重组率和完备性也就越高。,基因组DNA的切割,用于基因组文库构建的DNA片段的切割一般采用超声波处理和限制性内切酶部分酶切两种方法，其目的是：,第一，保证DNA片段之间存在部分重叠区,第二，保证DNA片段大小均一,载体和受体的选择,出于压缩重组克隆的数量，用于基因组文库构建的载体通常选装载量较大的-DNA或考斯质粒；对于大型基因组（如动植物和人类）需使用YAC或BAC载体。由于绝大多数真核生物的mRNA小于10 kb，因此用于cDNA文库构建的载体通常选质粒。,用于基因文库构建的受体则根据载体使用大肠杆菌或酵母菌。,从基因文库中筛选目的基因,大型基因组文库一般由数十万甚至上百万个重组克隆组成。除了一些具有特殊功能的蛋白质编码基因（如抗药性基因、结合蛋白编码基因等）可以采用特殊的正选择筛选程序（如抗药性筛选法、酵母双杂交技术等）直接筛选外，一般的基因组文库筛选均需多轮操作步骤。,从基因文库中筛选目的基因,密集铺板（1-10万）,目的重组克隆,杂交,取挖,铺板,铺板,作业：,简述基因工程实验中常规技术？,
