吸光光度法学时.ppt

第九章,吸 光 光 度 法Absorption Photometry,化学分析：常量组分(1%),Er 0.1%0.2%依据化学反应,使用玻璃仪器,化学分析与仪器分析方法比较,仪器分析：微量组分(1%),Er 1%5%依据物理或物理化学性质,需要特殊的仪器,例:含Fe约0.05%的样品,称0.2g,则m(Fe)0.1mg,重量法 m(Fe2O3)0.14mg,称不准,容量法 V(K2Cr2O7)0.02mL,测不准,光度法 结果0.048%0.052%,满足要求,准确度高,灵敏度高,9.1 概 述 9.1.1 吸光光度法的特点,特点灵敏度高：测定下限可达10-510-6mol/L 试样质量分数10-4%10-5%准确度：能够满足微量组分的测定要求 相对误差25 操作简便快速 应用广泛,吸光光度法是基于被测物质的分子对光具有选择性吸收的特性而建立起来的分析方法。,1.光的基本性质 电磁波的波粒二象性,c真空中光速 2.99792458108m/s3.0 108m/s波长，单位：m,cm,mm,m,nm,1m=10-6m,1nm=10-9m,1=10-10m频率，单位：赫兹（周）Hz 次/秒 n折射率，真空中为1,光的传播速度:,波动性,磁场向量,电场向量,传播方向,Y,Z,X,与物质作用,微粒性,h普朗克(Planck)常数 6.62610-34Js频率E光量子具有的能量 单位：J(焦耳)，eV(电子伏特),光量子，具有能量。,波粒二象性,结论:一定波长的光具有一定的能量，波长越 长(频率越低)，光量子的能量越低。,真空中:,2.光谱分区,能 量,小,200nm,400nm,750nm,波 长,光谱区域,紫外光区,可见光区,红外,分析方法,紫外吸光光度法,可见吸光光度法,1000um,红外吸光光度法,紫、蓝、青、绿、黄、橙、红,光的电磁波性质,不同颜色的可见光波长及其互补光,物质对光选择性吸收的实质一束光通过某物质时，该物质的分子、原子或离子与光子发生碰撞，光子的能量转移至分子、原子或离子上，使这些粒子发生能级变化，由基态跃迁至较高能态，这个过程即为吸收。光是否被物质吸收，取决于光子的能量物质的结构只有当能级差E 与光子能量h相当时物质才吸收光。,溶液颜色与光吸收的关系溶液对光的吸收：若溶液透明、均匀，人眼看到的溶液颜色是由透射光的波长决定的。当入射光为白光（复合光），溶液吸收的光与透射的光互补。互补光：组成白光的两种光。,光的互补：蓝 黄,吸光光度法：分子光谱分析法的一种，又称分光光度法，属于分子吸收光谱分析方法 基于外层电子跃迁,吸收光谱发射光谱散射光谱,分子光谱原子光谱,3.吸收光谱产生的原理,原子光谱为线光谱分子光谱为带光谱,电子跃迁能级分子振动能级分子转动能级,苯和甲苯在环己烷中的吸收光谱,最大吸收波长,300,400,500,600,700,/nm,350,525,Cr2O72-,MnO4-,Cr2O72-、MnO4-的吸收光谱,350,最大吸收波长,最大吸收波长,吸收曲线的特点不同的物质因其结构不同而具有不同的吸收曲线；同一物质，浓度不同，其吸收曲线的形状和max的位置不变，但在同一波长下吸光度随浓度的增大而增大。吸收曲线是吸光光度法选择测量波长的依据。,吸收光谱曲线：物质在不同波长下吸收光的强度大小 Al关系最大吸收波长 lmax：光吸收最大处的波长,4.一些基本名词和概念,lmax,对比度(l):络合物最大吸收波长(lMRmax)与试剂最大吸收波(lRmax)之差,l,9.1.2 光吸收的基本定律,一、朗伯-比尔(Lambert-Beer)定律吸光光度法的理论依据，研究光吸收的最基本定律,I0=Ir+It+Ia,T=It/I0,T:透射比或透光度 A=lg(I0/It)lg(1/T),A:吸光度,朗伯定律（1760年）：光吸收与液层厚度b成正比比尔定律（1852年）：光吸收与溶液浓度c成正比,A=lg(I0/It)=bc,试液和空白溶液分别置于一吸收池中，让强度为I0的单色光分别通过这两个吸收池，再测量其透过光的强度。此时反射光强度基本上是不变的，且其影响可以相互抵消。入射光强与吸收和透过光强关系为：I0=It+Ia,吸光度与光程的关系 A=bc,吸光度,0.42,光源,检测器,T透光率（透射比）（Transmittance）,A=lg(I0/It)=lg(1/T)=-lgT=kbc,T与A的关系,T 取值为0.0%100.0%,全部吸收 T=0.0%,全部透射 T=100.0%,吸光度A、透射比T与浓度c的理想关系,T=0.0%，A=,T=100.0%，A=0.0,T=36.8%，A=0.434,K 吸光系数 Absorptivity,当c的单位用g100mL-1表示时，用 表示，A bc，叫做比消光系数,灵敏度的表示方法:摩尔吸光系数(),A=b c=A/bc(Lmol-1cm-1),越大,灵敏度越高:11045104 为中等灵敏度;105为高灵敏度;104为低灵敏度.,解：c(Fe)=1.0 mg/L=1.010-3/55.85 mol/L=1.810-5 mol/L,例1 邻二氮菲光度法测铁(Fe)=1.0 mg/L,b=2.0 cm,A=0.38 计算 和,c=1.0 mg/L=1.0103 g/1000 mL=1.0104 g/100mL,二、朗伯-比尔定律的适用条件,1.单色光：应选用max处或肩峰处测定2.吸光质点形式不变 离解、络合、缔合会破坏线性关系 应控制条件(酸度、浓度、介质等)3.稀溶液(一般0.01 molL-1)浓度增大，分子之间作用增强,亚甲蓝阳离子水溶液的吸收光谱a.6.3610-6 mol/Lb.1.2710-4 mol/Lc.5.9710-4 mol/L,亚甲蓝阳离子单体 max=660 nm二聚体 max=610 nm,二聚体的生成破坏了A与c的线性关系,溶液浓度的测定,A bc,三、朗伯-比尔定律的分析应用,标准（工作）曲线绘制方法：在、b固定的情况下，测定一系列不同浓度的标准溶液的吸光度，作Ac图，在相同条件下测定样品溶液的吸光度，从曲线上可查出被测样品的浓度。,吸光度的加和性与吸光度的测量,A=A1+A2+An,用参比溶液调T=100%（A=0），再测样品溶液的吸光度，即消除了吸收池对光的吸收、反射，溶剂、试剂对光的吸收等。,吸光度的加和性：当某一波长的单色光通过一种含有多种吸光物质的溶液时，溶液的总吸光度应等于各吸光物质的吸光度之和。这一规律称吸光度的加和性。,目视比色法,9.1.3 比色法和吸光光度法及其仪器,2.光电比色法,通过滤光片得一窄范围的光(几十nm),3.吸光光度法和分光光度计,通过棱镜或光栅得到一束近似的单色光.波长可调,故选择性好,准确度高.,721型分光光度计,722型分光光度计结构方框图,光源,吸收池,检测系统,分光系统,分光光度计的主要部件,光源：发出所需波长范围内的连续光谱，有足够 的光强度,稳定。可见光区：钨灯(360800nm)紫外区：氢灯，氘灯(180375nm)单色器：将光源发出的连续光谱分解为单色光的 装置。棱镜:玻璃3503200nm,石英1854000nm 光栅:波长范围宽,色散均匀,分辨性能好,使用方便,棱镜：依据不同波长光通过棱镜时折射率不同将复合光色散为不同波长的单色光。,单色器,光栅：在镀铝的玻璃表面刻有数量很大的等宽度等间距条痕(600、1200、2400条/mm)。,原理：利用光通过光栅时发生衍射和干涉现象而分光.,吸收池：(比色皿)用于盛待测液及参比溶液。可见光区：光学玻璃池 紫外区：石英池检测器：利用光电效应，将光能转换成 电流讯号。光电池，光电管，光电倍增管指示器：低档仪器：刻度显示（如721）中高档仪器：数字显示，自动扫描记录,检测器,硒光电池,Ag、Au,光电管,红敏管 625-1000 nm蓝敏管 200-625 nm,光电倍增管,待扫描,160-700 nm,1个光电子可产生106107个电子,分光光度计的类型,多通道仪器（Multichannel Instruments）,光电二极管阵列(通常具有316个硅二极管)photodiode arrays(PDAs)同时测量200820nm范围内的整个光谱,比单个检测器快316倍,信噪比增加 316 1/2 倍.,其他类型分光光度计,将光度计放入样品中,原位测量.对环境和过程监测非常重要.,纤维光度计,镀铝反射镜,纤维光度计示意图,纤维光度计,9.2.1 显色反应,9.2 光度分析法的设计,9.2.2 显色条件的选择,9.2.3 测量波长和吸光度范围的选择,9.2.4 参比溶液的选择,9.2.5 标准曲线制作,9.2.1 显色反应 1.显色反应的选择(络合反应),*灵敏度高，一般104*选择性好*显色剂在测定波长处无明显吸收。对照性好,对比度max60nm。*反应生成的有色化合物组成恒定，稳定。*显色条件易于控制，重现性好。,2.显色剂与显色反应,无机显色剂:SCN-Fe(SCN)2+H2O2 TiOH2O22+,有机显色剂:,有机显色剂,OO型：,ON型：,吡啶偶氮间苯二酚(PAR),S型：,双硫腙,NN型：,丁二酮肟(Ni2+),邻二氮菲(Fe2+),磺基水杨酸-Fe3+,3.多元络合物与显色反应,a.三元混配络合物：Nb-5-Br-PADAP-酒石酸，V-PAR-H2O2,b.离子缔合物：AuCl4-罗丹明B主要用于萃取光度测定,c.金属离子络合剂表面活性剂体系：AuI4-CTMAB,d.杂多酸：HSA-SiW,Spectroscopy and Spectral AnalysisVol.24,No.12,pp1630-1633,December,2004,Chinese Journal of Applied ChemistryVol.20,No.9,pp833-837,Sep.2004,1.显色反应酸度（c(M)、c(R)一定）,pH1pHpH2,pH,9.2.2 显色条件的选择,c(R),c(R),c(R),2.显色剂用量（c(M)、pH一定）,Mo(SCN)32+浅红Mo(SCN)5 橙红Mo(SCN)6-浅红,Fe(SCN)n3-n,3.显色温度及显色时间,T1(),T2(),t(min),A,4.溶剂,有机溶剂:降低有色化合物的解离度，提高显色反应的灵敏度 影响有色络合物的溶解度和组成，提高显色反应的速率,5.显色反应的干扰及消除,测Co2(含Fe3+):(掩蔽法),(1)化学法,测Co2:(生成络合物性质不同),如不能通过控制酸度和掩蔽的办法消除干扰，则需采取分离法。,测Fe3:(控制pH),(2)物理法,选择适当的测定波长,1.仅络合物有吸收，溶剂作参比。如 phenFe2+标准曲线2.待测液也有吸收，被测液作参比。如 测汽水中的 Fe3.显色剂或其他试剂也有吸收，空白溶液作参比 例:邻二氮菲光度法测Li2CO3中的 Fe，参比溶液为不含Li2CO3样品的所有试剂。4.干扰组分与显色剂有反应,又无法掩蔽消除时：1）掩蔽被测组分，再加入显色剂，作参比.2）加入等量干扰组分到空白溶液中,作参比.,-选择适当的参比溶液,1 测定波长选择,选择原则：“吸收最大，干扰最小”,灵敏度,选择性,9.2.3 测量波长和吸光度范围的选择,2 测定浓度控制,控制浓度 吸光度A：0.20.8,减少测量误差,9.2.4 参比溶液的选择,仪器调零消除吸收池壁和溶液对入射光的反射和吸收 扣除干扰,试剂空白试样空白褪色空白,9.2.5 标准曲线制作,理论基础：朗伯-比尔定律,标准（工作）曲线绘制方法：在、b固定的情况下，测定一系列不同浓度的标准溶液的吸光度，作Ac图，在相同条件下测定样品溶液的吸光度，从曲线上可查出被测样品的浓度。,The linearity relation of scavenging effect of hydroxyl radical with aqueous extraction from eleochairis toberosa peel,9.3 光度分析法的误差,不过原点：,发生偏离：,1 非单色光引起的偏移,复合光由l1和l2组成，对于浓度不同的溶液a和b，引起的吸光度的偏差不一样，浓度大，复合光引起的误差大，故在高浓度时线性关系向下弯曲。,9.3.1 对朗伯-比尔定律的偏移,非均匀介质 胶体，悬浮、乳浊等对光产生散射，使实测吸光度增加，导致线性关系上弯,2 物理化学因素,离解、缔合、异构等如：Cr2O72-+H2O-=2HCrO4-=2H+2CrO42-PAR的偶氮醌腙式,化学反应,吸光度标尺刻度不均匀,9.3.2 吸光度测量的误差,dc/c=dA/A=dT/(TlnT),Er=dc/c100=dA/A100=dT/TlnT100,P326 P327,浓度测量的相对误差Er与T(或A)的关系,实际工作中，应控制T在15%65,A在0.20.8之间(调c,b,)，相对误差4%,1.示差吸光光度法目的：提高光度分析的准确度和精密度 解决高(低)浓度组分(A在0.20.8以外)问题分类：高吸光度差示法、低吸光度差示法、精密差示吸光度法特点：以标准溶液作参比溶液原理：A相对=A=bcx-bc0=bc准确度：读数标尺扩展,相对误差减少 c0愈接近cx,准确度提高愈显著 结果计算：cx=c0+c,9.4 常用的吸光光度法,例：用普通分光光度法测得标液C1的透光率为20%，试液的透光率为12%，若以示差法测定，以C1为参比，则试液的透光率为 A.40%B.50%C.60%D.70%,答案：C.60%,1.单一组分测定,1)金属离子:Fe-phen,Ni-丁二酮肟,Co-钴试剂,2)磷的测定:DNA中含P9.2%,RNA中含P9.5%,可得核酸量.,H3PO4+12(NH4)2MoO4+21HNO3=(NH4)3PO412MoO3+12NH4NO3+12H2O,磷钼黄(小),磷钼(V)蓝(大),9.5 吸光光度法的应用,3)蛋白质测定溴甲酚绿、考马司亮蓝等4)氨基酸测定茚三酮(紫色化合物)5)水质检测:NH4+、NO2-、Mn2+、Fe2+、SO42-、Hg2+-6)药物含量测定比吸光系数定量；荷移光谱法测定.7)紫外吸收(UV):NO2-、NO3-、SO42-、SO32-、CO32-、SCN-、酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、蛋白质等。,2.多组分的测定,xl1,eyl1,exl2,eyl2由x,y标液 在1,2处分别测得,在1处测组分x,在2处测组分y,b)在1处测组分x;在2处测总吸收,扣除x吸收,可求y,c)x,y组分不能直接测定A1=exl1bcx+eyl1bcy(在1处测得A1)A2=exl2bcx+eyl2bcy(在2处测得A2),3.测定弱酸和弱碱的离解常数,AHB和AB-分别为有机弱酸HB在强酸和强碱性时的吸光度，它们此时分别全部以HB或B-形式存在。,HB H+B-,pKa=pH+lg,HB,B-,A=AHB+AB-,对pH作图即可求得pKa,P133(5-30)：,4.络合物组成确定,饱和法（摩尔比法）,制备一系列含钌3.010-5 mol/L(固定不变)和不同浓度（小于12.010-5 mol/L）的PDT溶液，按实验条件，485nm测定吸光度,作图。,PDT:Ru=2:1,等摩尔连续变化法,固定M+L,改变M,获得一系列吸光度值，吸光度最大的值所对应的M与L的比值，即获得M:L比值。,Co(III)与3，5二氯PADAT的比值为1:2,平衡移动法,固定M,不断改变L，以lgMLn/M为纵坐标，lgL为横坐标，作图，斜率n即是络合物中L:M的比值；纵轴上的截距lgK是络合物的稳定常数。,lgK+nlgL=lg(MLn/M),lgK+nlgL=lgA/(Amax-A),9.1 了解分子对光的吸收与溶液颜色的关系.吸收曲线定性分析的基础。定量分析的基础朗伯-比尔定律：A=bc=-lgT 式中 各参数的物理意义，定量计算。9.2 了解目视比色法、分光光度法的特点，分光光度计的基本部件。9.3 灵敏度的表示摩尔吸光系数的意义和计算；准确度适宜的测量范围、偏离比尔定律的原因。9.4 显色反应及条件的确定:显色剂用量、酸度、时间、温度、干扰及消除。9.5 应用:单一组分测定示例、多组分测定、光度滴定、络合物组成的测定、酸碱离解常数的测定。,第9章 小 结,第四节 光度分析的步骤一、显色剂的选择（1）反应的选择性好，干扰少，或干扰容 易消除。（2）生成的有色化合物有较高的摩尔吸光 系数，灵敏度足够高，适用于试样中 待测物质的含量范围。,二、实验条件的选择（一）溶液的酸度酸度直接影响显色剂的浓度和生成物的颜色。（二）显色剂用量 为了使显色反应进行完全，需加入过量 显色剂，在实际工作中，通常根据试验 来确定。,（三）显色时间及颜色的稳定性 必须通过试验来确定在最合适的时间内进行测定。（四）温度 大多数的显色反应在室温下进行，但有些显色反应必须加热至一定的温度和一定时间才能完成。,（五）溶剂 有机溶剂对显色反应的影响为：（1）影响络合物的离解度；（2）影响反应速度。,（六）干扰物质的影响及消除方法（1）干扰物质本身有颜色或与显色剂 形成有色化合物，在测量条件下 也有光吸收。（2）在显色条件下，干扰物质析出沉 淀或使溶液混浊，以致无法进行 光度测量。（3）与待测离子形成更稳定的络合。,消除办法：（1）控制酸度；（2）加入适当掩蔽剂；（3）选择适当的测量波长；（4）选择适当的参比溶液。,三、分析波长的选择（1）如果不存在其它有色物质的干 扰，则选择待测有色物（或显色 剂生成的产物）的最大吸收波长 的光波作为入射光进行光度测 定。,（2）如果显色剂本身有颜色，且在有 色物质的最大吸收波长下也有光 吸收，最好选择有色物质有较大 光吸收的波长而显色剂（或其它 有色物质）在此波长下的光吸收 为零的单色光作为入射光。,四、参比溶液的选择（1）当试液本身及显色剂均无色，可用 蒸镏水作参比溶液。（2）显色剂无色，但待测试液中有其它 有色物质存在，可采用不加显色剂 的待测试液作参比溶液。（3）如显色剂有颜色，则要用试剂空白（不加试样溶液）作参比溶液。,（4）如显色剂和试液均有颜色，则可 取两份试液，其中一份先加入适 当掩蔽剂将待测组分掩蔽使之不 与显色剂作用，然后两份试液都 加入显色剂及其它试剂，将加入 掩蔽的那份试液作参比溶液。,五、标准曲线的制作 配制一系列不同含量的标准溶液，分 别置于比色皿内，选择合适的入射光 波长，用参比溶液调整光度计的零 点，然后把入射光照射到盛有标准溶 液的比色皿上，测得吸光度值。根据 标准溶液中 待测组分的量对吸光度作 图得一直线叫标准曲线。测量的吸光度最好在：0.2-0.8 范 围内,第五节 朗伯-比耳定律的偏离一、非单色光引起的偏离 朗伯-比耳定律只适用于单色光，单色光的纯度与仪器的质量有关，性能好的分光光度计，所得的入射光的波长范围较窄，即“单色光”纯度较高，标准曲线的线性范围也大。,二、溶液本身的化学因素引起的偏离（一）溶液中的化学反应（1）生成络合物的浓度不同；（2）剩余显色剂量多少不同和离解程 度不同。,（二）介质的不均匀性 不均匀的介质主要包括：（1）待测试液是胶体溶液；（2）待测试液是乳浊；（3）待测试液有悬浮物。,第八节 吸光光度法的应用一、单组分或多组分的分光测定要求:要求两种或两种以上的有色物质 的吸收光谱有较大的差异，最大 吸收峰位置有相当距离即可。,吸光度的加和性：如果两个组分的吸光质点对某一波长 的单色光均有吸收作用，而且这两种 吸光质点之间相互不发生化学作用，当 用单色光通过此溶液时，从理论和实验 都可证明，溶液的总吸光度等于各组分 的吸光度之和。,第九节 差示（差分）分光光度法采用一个比待测试液浓度稍低的标准溶液作为参比溶液以代替一般吸光光度法的参比溶液。定量基础：相对吸光度与浓度差成正 比。,第十节 双波长分光光度法采用一个比待测试液浓度稍低的标准溶液作为参比溶液以代替一般吸光光度法的参比溶液。,定量基础：试液在两个波长下的吸光度差值与待测组分的浓度成正比。,作业 P332-333习题：2，3，4，5，10,