双向凝胶电泳技术.ppt
双向凝胶电泳技术two-dimensional gel electrophoresis technology(2DE),定义一：以凝胶为载体的双向电泳。定义二：根据蛋白质的等电点和分子量大小，分别在凝胶介质二维空间上对蛋白质分子进行等电点聚焦和电泳来分离与纯化蛋白质的方法。双向凝胶电泳的原理：该技术是在1975年由意大利生化学家OFarrell 发明的。根据蛋白质等电点和分子量的差异，连续进行成垂直方向的两次电泳。第一向为等电聚焦（Isoelectric facusing，IEF)电泳，其基本原理是利用蛋白质分子的等电点不同进行蛋白质的分离。第二向为十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE),它是按蛋白质分子量的大小进行分离的,再用考马斯亮兰或P银染进行检测，经Pdquest等软件对结果进行对比，解析。,2D-PAGE技术应用中的关键步骤：1、样品制备（蛋白提取）：（1）细胞培养、处理和收集；（2）将细胞在IEF裂解缓冲液中溶解；（3）将样品离心以去除不容的细胞碎片和DNA，提取上 清，-80 保存。2、蛋白质定量和上样：（1）固相PH梯度干胶条（immobi-linePH Gradient,IPG）水化、等电聚焦；（2）IPG的平衡；（3）SDS-PAGE；(4)蛋白质检测：考马斯亮兰染色或银染色；3、图像分析及数据处理：将染色后凝胶放在GS-710,光密度扫描仪上，扫描后的图像用PDQUEST 2DE软件分析，选择部分匹配的蛋白质斑点进行比较。,制备原则：由于双向电泳所分析样品的多样性，没有一种通用的制备方法适用于各种样品。但有几条共同的原则需要遵循（1）尽可能溶解全部蛋白质，打断蛋白质之间的非共价键结合，使样品中的蛋白质以分离的多肽链形式存在（2）避免蛋白质的修饰作用和蛋白质的降解作用（3）避免脂类、核酸、盐等物质的干扰作用（4）蛋白质样品与第一向电泳的相容性。,蛋白质样品处理：在制备蛋白质样品的过程中，最好适用Dnase（脱氧核糖核酸酶）和RnaseA（核糖核酸酶）来降解核酸。如果样品中含有较多的核酸会增加样品的粘性并造成非斑点处的背景拖迹，甚至还可能封闭凝胶孔。在蛋白样品裂解时，应以溶解尽可能多的蛋白质和保持在整个双向电泳过程中蛋白质的溶解性为主要目标。目前增加蛋白质溶解性的方法主要是适用变性剂，如尿素、硫脲，可以打破蛋白质的高级结构，打断非共价连接。,双向电泳的应用 双向电泳的分辨率较高，自第一次应用该技术以来，其分辨率已从15个蛋白质点发展到10000多个蛋白质点。一般的双向电泳也能分辨1000-3000个蛋白质点。因此，双向电泳被广泛应用与农业，医学等研究领域。由于蛋白质的等电点和分子量是两个彼此不相关的重要性质，而2DE 同时利用了蛋白质间的这两个性质上的差异分离蛋白质，因此2DE的分离能力非常强大，它甚至能将细胞中5000种蛋白分离开，2DE 在分离蛋白混合样品，比较差异方面有不可替代的作用，结合质谱鉴定技术可查明大型蛋白复合物各组组分，与其他生物技术如分子生物学，分子遗传工程，免疫学，微量蛋白质的自动氨基酸序列分析相结合，可以快速准确的 发现和鉴定新的蛋白质。,双向凝胶电泳技术当前面临的挑战是：,(1)低拷贝蛋白的鉴定。人体的微量蛋白往往还是重要的调节蛋白。除增加双向凝胶电泳灵敏度的方法外，最有希望的还是把介质辅助的激光解吸/离子化质谱用到PVDF膜上，但当前的技术还不足以检出拷贝数低于1000的蛋白质。(2)极酸或极碱蛋白的分离。(3)极大（200kD）或极小（10kD蛋白的分离。(4)难溶蛋白的检测，这类蛋白中包括一些重要的膜蛋白(5)得到高质量的双向凝胶电泳需要精湛的技术，因此迫切需要自动二维电泳仪的出现。,Thank you,细胞处理：对于组织细胞，首先需将其破碎，尽可能地将蛋白质组分溶解在缓冲液中，以便在适当的电泳条件下分离。组织细胞破碎的方法包括低渗、匀浆、超声、反复冻融等。而对于体液成分，如血清、腹水、尿液等，仅需经过稀释、加热变性、溶解于适当缓冲液便可用于双向电泳。,等电聚焦 等电聚焦是20世纪60年代建立的蛋白质分离技术，基本原理是利用蛋白质或其它两性分子等电点的不同，在一个稳定的、连续的pH梯度中进行分离和分析。IEF具有分辨率高（0.01pH单位）、抵消扩散作用、可使浓度较低的样品达到高度浓缩等优点，不仅可以用来分离两性大分子，还可以通过测定等电点来鉴定蛋白质。根据建立pH梯度的原理不同，可以分为载体两性电解质pH梯度（Carrier ampholytes pHgradients）和固体pH梯度（Immobilized pHgradients）。前者是在电场中通过两性缓冲离子建立pH梯度，后者是将缓冲基团作为凝胶介质的一部分，分辨率比前者提高一个数量级。根据电泳方式的不同，IEF可分为管状、薄层、垂直和水平等电聚焦。聚焦完成后，胶条既可以在中间电压500-1000V下短时间保持，便于随时进行第二向的平衡，也可以置于-80冰箱中进行长期保存。,IPG胶条平衡 在第二向SDS-PAGE分离前，必须要平衡IEF胶。主要目的是用含有SDS的第二向介质置换含有尿素的第一向介质，使分离蛋白质与SDS能完全结合，保持蛋白质的巯基呈还原状态，避免发生重氧化，确保在SDS-PAGE过程中正常迁移。聚焦后的蛋白质在IEF胶内处于其等电点处，净电荷为零，若未进行平衡过程而直接进入第二向的SDS-PAGE分离，蛋白质仍滞留在IEF胶中不能在第二向凝胶中正常迁移。胶条平衡包括两个简单的步骤，每步10-15分钟，第一步是将IEF胶在375mmol/L Tris-HCl Ph8.8缓冲液（含2%SDS、1%DTT或6mol/L尿素和30%甘油）中浸泡10-15分钟，尿素和甘油是用于缓冲电渗效应，提高蛋白质从第一向到第二向的转移率。第二步用5%碘乙酰胺替代还原剂DTT的375mmol/L Tris-HCl pH8.8缓冲液，其他组分及相应浓度不变。碘乙酰胺用来烷基化巯基变成羟乙酰半胱氨酸残基，以便巯基不能重组形成二硫键。此外，碘乙酰胺还可以烷基化IEF胶内的自由DTT，否则自由DTT在第二向SDS-PAGE胶迁移，会产生点条纹的假象。为减少酰胺基组的烷基化，最好在pH8-9之间进行还原和烷基化。,SDS-PAGE 第二向SDS-PAGE有垂直和水平两种方式。垂直方式的特点是可以同时走多张胶，且可以是较厚的凝胶，有利于提高上样量，电泳后可有足够的蛋白量进行进一步分析。缺点是需要大量的缓冲液，电泳时间长，分辨率低，不便于保存，凝胶大小、厚度可任选，可用半干技术。由于有支持膜，更便于长期保存，平衡后的IPG胶可以被水平或垂直放在SDS-PAGE胶上，用0.8%低熔点琼脂糖封胶，固定IPG胶，以防电泳时滑动或漂移。,染色 常用蛋白质点的染色方法有考马斯亮兰、银染、荧光染料等，其中银染法灵敏度高，可以在电泳图中找到含量较低的蛋白，所需的上样量较少（每点仅需0.1mg），可以检测到小于1ng的蛋白点，但线性范围小于2个最高数量级。所有银染方法都是温度依赖的，而且需要精确控时的 操作，决定何时终止染色全凭个人的经验，因此，银染是3种染色法中重现性最差的。考马斯亮兰是3种染色法中灵敏度最低的，检测限度约为每点10ng蛋白，但可以染色多种蛋白质，并能与蛋白量呈两个最高数量级的线性关系。用考马斯亮兰染色的蛋白点成蓝色，可以用可见光扫描仪捕获胶图。荧光染色法是一种终点染色方法，可以检测到大约1ng的蛋白点，荧光染色法与蛋白量呈3个最高数量级的线性关系，需用荧光扫描仪显示用荧光染色法染色的蛋白点。,分离蛋白质的检测与匹配分析 目前常用的图像分析软件有PDQUEST(Bio-Rad）、MELANIE（SIB,GenBio）、Irnagemaster（APB)、Advanced 2-D Software（Phoretix）和I-IT Ivestigator(GSI),图像分析软件能提供综合管理各种分离和分析过程所必须的控制和分析的功能。2-D PAGE分析软件确定并定量双向凝胶上蛋白点，去除背景方式，匹配相关胶图，比较相关胶图上相应蛋白点强度，准备显示报告的凝胶数据以及输出胶图信息到数据库。图像分析软件也能指导手工或点自动切割机械手进行胶上蛋白点的切割，以作进一步的分析。,样品的溶解直接关系到分离的分辨率，为使尽可能多的蛋白质溶解，必须完全破坏分子间的相互作用，把蛋白质复合物解聚和变性为单体形式，使其在整个分离过程以多肽链形式存在，同时要避免对蛋白质的任何化学修饰。一些疏水蛋白尤其是膜蛋白很难溶解，为了促进其溶解，常加入一些增溶剂如变性剂、表面活性剂、还原剂等，变性剂的作用是破坏氢键，使蛋白质解折叠和变性。它不仅作用于蛋白质，还可用于周围溶剂（通常是水）。尿素是2D-PAGE中最常用的变性剂，其作用是可逆的，在凝胶中的浓度必需保持在8mol/L以上。当尿素与硫脲结合使用时，极大地提高了膜蛋白的溶解，由于硫脲难溶于水，高浓度的尿素能促进硫脲的溶解，因此2mol/L硫脲常在5-7mol/L尿素浓度下使用，硫脲浓度大于2mol/L会降低等电聚焦(IEF)分辨率，可能是其抑制SDS-蛋白质结合的缘故。,
