卫生检验蛋白质.ppt

临床生化检验,吉大一院检验科孙淑艳 教授,本次课的主要内容,.蛋白质代谢检查.糖代谢检查三.离子测定,一 蛋白质代谢检查,(一)TP测定:方法、原理、操作、临床意义及注意事项(二)ALB测定:方法、原理、操作、临床意义、注意事项,（一）TP测定,TP测定方法简介:TP测定时常利用蛋白质的一些特性,如重复的肽键结构;酪氨酸和色氨酸残基对酚试剂反应或紫外光吸收;与色素结合的能力;沉淀后的浊度;电泳的迁移率大小等来设计蛋白质的测定方法。经典和常见的方法分述如下：凯氏定氮法:是经典的蛋白质测定方法,准确性好、精密度和灵敏度高、是公认的参考方法。但操作复杂、费时,主要用于标准蛋白质的定值和对其他方法的校正。双缩脲法：特异性高、准确度和精密度好，方法简便、显色稳定。虽然灵敏度不高，但能满足临床对血清TP定量测定要求，是临床测定血清TP的常规方法。,（一）TP测定,1.TP测定方法简介:酚试剂法：灵敏度高达双缩脲法的100倍，有利于检出微量蛋白质，较合适于单一蛋白质检测。紫外分光光度法：利用蛋白质在280nm处有吸收峰的特点，常用于测定较纯的酶和免疫球蛋白。染料结合法：常用氨基黑、丽春红、考马斯亮蓝、邻苯三酚红钼等，前三者主要用于蛋白电泳，邻苯三酚红钼可用于尿液和脑脊液中蛋白质的测定，简便快速、灵敏，但不同蛋白质结合力不一样，且试剂对比色杯有吸附作用。化学比浊法：操作简便、灵敏度高，但影响浊度大小的因素较多，一般用于测定尿液、脑脊液等蛋白质含量较低的标本。,（一）TP测定,2.双缩脲法测定TP原理:蛋白质中的肽键在碱性溶液中与2价铜离子作用生成稳定的紫红色络合物,此反应和两个尿素分子缩合生成的双缩脲在碱性液中与铜离子作用形成紫红色的反应相似,故称之为双缩脲反应。这种紫红色络合物在540nm处有明显吸收峰,吸光度在一定范围内与血清总蛋白含量成正比,经与同样处理的蛋白质标准液比较,即可求得蛋白质含量。至少含2个-CONH-基团才能与Cu2+络合，故氨基酸及二肽无反应，三肽以上才能反应.碱性 蛋白质铜离子 紫色络合物 试剂:成品试剂(液体单一试剂)。双缩脲试剂含有：硫酸铜、酒石酸钾钠、碘化钾、NaOH。标准液:蛋白质含量：50g/L、60g/L 仪 器：生化自动分析仪、分光光度计。,(一)TP测定,3.双缩脲法测定TP 操作:(1).生化自动分析仪法 按试剂说明书提供的参数编程测定。(2).手工操作法:混匀，37 10min，波长540nm处比色，蒸馏水调零，测各管吸光度。计算,(一)TP测定,4.双缩脲法测定TP:临床意义:正常成人TP：60-80g/L(1)TP降低:见于蛋白合成障碍(肝功严重受损时，蛋白合成减少，以ALB降低最显著)、蛋白丢失增加(严重烧伤,大量血浆渗出;肾病综合征;溃疡性结肠炎)、营养不良或消耗增加、血浆稀释(如静注过多低渗溶液或各种原因引起的水钠潴留)。(2)TP增高：见于蛋白合成增加(多发性骨髓瘤,异常球蛋白增加)、血浆浓缩(急性脱水，外伤失血等)。,(一)TP测定,2.双缩脲法测定TP 注意事项(1)黄疸、严重溶血等有明显干扰,可用标本空白管消除。如果标本空白管吸光度太高，可影响结果准确度,使测定结果偏高。(2).脂血混浊血清会干扰比色,使测定结果偏高,可用乙醚抽提。(3).显色温度控制在371,使用经校正的高级分光光度计(波长带宽2nm),比色杯光径1Cm比色。(4).血清蛋白质的含量一般用g/L表示,因为各种蛋白质的分子量不同,不能用mol/L表示。(5).生化自动分析仪测定时，黄疸、溶血、脂血等不合格标本一搬不进行测定。,(一)TP测定,2.双缩脲法测定TP 方法特点(1).双缩脲显色反应仅和蛋白质中肽键数成正比,与蛋白质种类,分子量及氨基酸组成无明显关系,各种蛋白质显色程度基本相同,显色稳定性好,试剂单一。(2).双缩脲法重复性好,RCV4%,CCV3.9%;线性范围0-140g/L,干扰少,使用单一的稳定试剂,操作简单、快速,适于手工操作及自动化分析,为TP测定的参考方法。(3).唯一的缺点是灵敏度较低，比酚试剂法低约100倍,但能满足临床生化检验需要,对血清总蛋白定量较为适用;对蛋白质含量很低的其他体液如脑脊液、胸腹水和尿液等，不是合适的定量方法。(4).双缩脲法是临床测定血清TP首选最方便、最实用的常规方法。,(二)白蛋白测定（ALB）,1.溴甲酚绿法测定ALB:原理 ALB在PH4.2的缓冲液中带正电荷，在有非离子型表面活性剂存在时,可与带负电荷的染料溴甲酚绿结合形成蓝绿色复合物，在波长630nm处有吸收峰,其颜色深浅与ALB浓度成正比例,与同样处理的ALB标准比较,可求出ALB含量。pH4.2 白蛋白溴甲酚绿 蓝绿色复合物试剂:成品试剂,琥珀酸缓冲液、溴甲酚绿、聚氧化乙烯月桂醚（Brij-35）、叠 氮钠白蛋白标准液:40g/L,(二)ALB测定,2.溴甲酚绿法测定ALB 操作(1).生化自动分析仪分析法(2).手工操作法波长628nm,空白管调零,试剂与血清标本混合后,立即在303s读取吸光度。计算,(二)ALB测定,3.溴甲酚绿法测定ALB 临床意义：参考值34-48g/L(1).ALB增高:常见于严重脱水所致血浆浓缩。(2).ALB降低:与TP降低原因大致相同,主要见于:蛋白合成障碍，蛋白丢失增加,营养不良或消耗增加,血浆稀释。急性降低主要见于大出血和严重烧伤；慢性降低见于肾病蛋白尿、肝功受损、肠道肿瘤及结核病、慢性出血、营养不良和恶性肿瘤等。血清ALB低于20 g/L,临床出现水肿。(3).A/G比值 正常为1.5-2.5/1,ALB减少和/或球蛋白升高，A/G降低,严 重者A/G1.0，称为A/G比值 倒置。(4).先天性ALB缺乏症：ALB合成障碍，极少见。,(二)ALB测定,4.溴甲酚绿法测定ALB 注意事项(1).BCG是一种PH指示剂,变色域PH3.8(黄色)-5.4(蓝绿色),控制反应液 PH是本方法的关键。(2).BCG试剂也可用其他缓冲液如枸橼酸盐或乳酸盐缓冲液。但琥珀酸盐缓 冲液的校正曲线通过原点,线性好,灵敏度高,为首选推荐配方。(3).Brij-35也可用其他表面活性剂代替,如吐温-20或吐温-80,灵敏度和线 性范围不变。(4).60g/L的白蛋白标准液与BCG结合后,在光径1.0cm,630nm测定吸光度应 为0.811 0.035，如达不到此值，灵敏度较差。(5).BCG不但与ALB呈色,与血清中多种蛋白成分呈色,其反应速度较ALB慢.故BCG与血清混合后，在30s内读取吸光度,可明显减少非特异呈色反应。为减少基质效应，最好用参考血清作标准。,(二)ALB测定,5.溴甲酚绿法测定ALB 方法特点(1).本法操作简便、快速,黄疸、溶血和中度脂血无干扰,可手工操作,也可自动化分析,是目前国内测定ALB的常用方法。(2).本法线性范围10-60g/L，RCV4%。与溴甲酚紫法(BCP)比较,对 ALB特异性较差.。,(二)ALB测定,6.溴甲酚紫法测定ALB 原理 ALB在PH5.2的缓冲液中带正电荷,在有Brij-35存在，可与带负电荷的染料溴甲酚紫(BCP)结合形成绿色复合物，在波长603nm处的吸光度与ALB浓度成正比，与同样处理的ALB标准比较，可求出血清中的ALB含量。pH5.2 ALB溴甲酚紫 绿色复合物试剂:成品试剂。醋酸缓冲液、溴甲酚紫、聚氧化乙烯月桂醚（Brij-35）、叠氮钠。ALB标准液:40g/L仪器:生化自动分析仪、分光光度计。,(二)ALB测定,7.溴甲酚紫法测定ALB 操作(1).生化自动分析仪分析法(2).手工操作法 混匀，1min后603nm比色，空白管调零，读取吸光度。计算,(二)ALB测定,8.溴甲酚紫法测定ALB 参考值：36-46g/L注意事项：(1).BCP溶液PH必须控制在5.20 0.03范围内。(2).严重脂血对测定有干扰，应加做标本空白予以校正。评价:BCP反应最适PH为5.20,接近-和-球蛋白的等电点,抑制了这两种球蛋白与BCP的非特异性反应,对测定ALB有较高的特异性.进口试剂多为此法。BCP与ALB的反应为即时完全反应,不受时间和温度变化的影响,呈色后稳定1h以上。本法兼有BCG法的所有优点,克服了BCG的多数缺点,成为测定血清ALB染料结合法中较好的一种方法。BCP法优点:受球蛋白和其他血浆蛋白干扰较小,对测定ALB有较高的特异性.与BCG法相比,灵敏度较低.此外,溴甲酚紫与非人源性的白蛋白结合力相当弱,与牛、猪等动物血清反应性仅为BCG的1/3，不适用于测定动物标本中的白蛋白,机制尚待阐明。,二 糖代谢检查,(一)血糖测定:原理、操作、临床意义及注意事项(二)糖化血红蛋白测定:原理、操作、临床 意义、注意事项,(一)血糖测定,1.葡萄糖氧化酶法(glucose oxidase,GOD)测定葡萄糖 原理:利用氧和水将GLU氧化为葡萄糖酸,并释放H2O2。过氧化物酶(POD)在色原性氧受体存在时将H2O2分解为水和氧,并使色原性氧受体4-氨基安替比林和酚去氢缩合为红色醌类化合物,即Trinder反应.红色醌类化合物的生成量与GLU含量成正比。试剂:成品试剂(液体双试剂).R1:磷酸盐缓冲液:磷酸盐、4-氨基安替比林、葡萄糖氧化酶;R2:过氧化物酶、苯酚.葡萄糖标准液:5mmol/L仪器：生化自动分析仪、分光光度计,(一)血糖测定,2.葡萄糖氧化酶法(glucose oxidase,GOD)测定葡萄糖操作：（1）生化自动分析仪法 按仪器说明书操作。（2）手工操作法 混匀,置37水浴15min，在波长505nm处比色，空白管调零，读取标准管和测定管吸光度。计算,(一)血糖测定,3.血糖测定临床意义 空腹血清葡萄糖为血糖升高见于：(1)生理性高血糖:摄入高糖食物后或情绪紧张肾上腺素分泌增加.(2)病理性高血糖见于：.糖尿病:胰岛素绝对或相对不足.内分泌腺功能障碍:甲亢、肾上腺皮质及髓质功能亢进及对抗胰岛素的激素分泌过多.应激性高血糖：颅内压增高刺激血糖中枢,如颅外伤、颅内岀血、脑膜炎等,(一)血糖测定,3.血糖测定临床意义 血糖降低见于：（1）.生理性低血糖 见于：饥饿和剧烈运动（2）.病理性低血糖：特发性功能性低血糖最多见,依次是药源性、肝源性、胰岛素瘤等.胰岛细胞增生或胰岛细胞瘤等,使胰岛素分泌过多.对抗胰岛素的激素分泌不足,如垂体前叶、肾上腺皮质和甲状腺功能减退而使生长素、肾上腺皮质激素分泌减少.严重肝病患者,由于肝脏储存糖原及糖异生等功能低下,肝脏不能有效调节血糖.,(一)血糖测定,4.葡萄糖氧化酶法测定葡萄糖注意事项：（1）.葡萄糖氧化酶（GOD）对-D-葡萄糖高度特异,葡萄糖完全氧化需要型到型的变旋 反应.某些试剂盒含葡萄糖变旋酶,可加速变旋.终点法中,延长孵育时间 可自发变旋.新配的葡萄糖标准液主要是型,需放置2h以上方可应用.（2）.本法可直接测定CSF葡萄糖含量,但不能直接测定尿葡萄糖含量.因尿 中尿酸等物质浓度过高,干扰过氧化物酶(POD)反应,造成结果假性偏低.（3）.标本以草酸钾-氟化钠抗凝血浆较好.可抑制糖分解（4）.本法用血量甚微,操作中应直接加标本至试剂中,再吸试剂反复冲洗吸 管,以保证结果可靠（5）.严重黄疸、溶血及乳糜血应先制备无蛋白血滤液,再测定,(一)血糖测定,4.葡萄糖氧化酶法测定葡萄糖注意事项（6）.过氧化物酶(POD)特异性比葡萄糖氧化酶(GOD)低得多,一些还原性物质如尿酸,抗坏血酸,多巴胺,胆红素和谷胱甘肽等,可与色原性物质竞争H2O2,使结果偏低（7）.住院患者血糖低于参考值而无低糖表现,可能的原因是：.GOD-POD法受药物影响,住院患者每天输液,VitC、多巴胺广泛应用,血液中高浓度的药物引起负干扰.标本采集不合格，血液凝固后未能及时离心,建议重新采集标本.新生儿胆红素对该法有负干扰（8）.住院患者血糖异常升高,应与临床联系,查询是否为糖尿病患者,与其尿糖是否相符,一旦不符,应询问标本采集时是否正输葡萄糖.如是建议重新采集标本,(一)血糖测定,5.葡萄糖氧化酶法测定葡萄糖方法特点：（1）.线性范围可达22.24mmol/L,回收率94-105%,变异系数批内0.7-2.0%,批间CV2%左右,日间2-3%.准确度和精密度都能达到临床要求，操作简便，适用于常规检验。GOD法也适于测定脑脊液葡萄糖浓度。GOD法不能直接用于尿标本测定，可使用离子交换树脂除去尿中干扰物再测定。（2）.本法反应式中第一步是特异反应,第二步特异性较差.一些还原性物质如尿酸,抗坏血酸,多巴胺,胆红素和谷胱甘肽等,可与色原性物质竞争H2O2,从而消耗反应产生的H2O2,使结果偏低,三.离子测定,(一)钾、钠测定:原理、操作、临床意义 及注意事项(二)氯化物测定:原理、操作、临床意义及注意事项,(一)钾、钠测定,钾钠测定方法有火焰发射光谱法、离子选择性电极法等，目前采用离子选择性电极法比较多。离子选择电极(ISE)法原理：以测量电池电动势为基础的定量分析方法。将离子选择电极和一个参比电极连接起来，置于待测电解质溶液中，构成一个测量电池，此电池的电动势与被测离子活度的对数符合能斯特(Nernst)方程。离子选择电极由钾、钠离子活度的作用产生不同电位。这种电位变化由离子活度决定，与钾、钠离子浓度成正比。离子选择电极法测定钾、钠分直接电位法、间接电位法、多层膜干片法。,(一)钾、钠测定,离子选择电极法（ISE）1.直接电位法 样本或标准液不经稀释直接进入ISE管道作电位分析，因为ISE只对水相中离解离子选择性的产生电位，与样品中脂肪、蛋白质所占体积无关，即不受能改变血清中水体积比例的高蛋白血症和高脂血症等影响。2.间接电位法 样本或标准液要用指定离子强度与pH值的稀释液作高比例稀释，再输入电极管道测定。该法会受到样品中脂类和蛋白质占据体积的影响。一些没有电解质失调而有严重高脂血症和高蛋白血症的样品，由于单位体积血清中水量明显减少，定量吸取样品作稀释后，间接电位法 测定会得到假性低钠、钾血症。3.多层膜干片法 采用样本间相互独立的干式离子敏感卡片，参比 测量池与离子测量池之间用盐桥连通，测量参比池与测量池的电位差。,(一)钾、钠测定,试剂 间接ISE法时高低浓度斜率液及血清用指定pH、离子强度的稀释液作高度稀释。直接ISE法是测定离子活度的，离子活度与溶液pH值及离子强度有关。仪器 钠、钾离子选择性电极的分析仪1.钾电极 是对K有选择性响应的缬氨酶素液膜电极。此敏感膜的一侧与电极电解液接触，另一面与样品液接触，膜电位的变化与样品中K活度的对数成正比2.钠电极 由对Na具有选择性响应的特殊玻璃毛细管组成。钠电极 与参比电极之间的电位差随样品溶液中Na活度的变化而变化3.参比电极 通常由Ag/AgCl组成，保持一个恒定不变的电位,(一)钾、钠测定,临床意义 参考值 血清钾钾在人体的主要生理功能是:参与细胞内的正常代谢；维持细胞内容量、离子、渗透压及酸碱平衡；维持神经肌肉的应激性；维持心肌的正常功能。,(一)钾、钠测定,临床意义 血清钾参考范围：1.低钾血症:血清钾低于3.5mmol/L(1)钾摄入不足:如慢性消耗性疾病长期进食不足使钾来源减少,而肾照常排钾.(2)钾排出增多:如严重呕吐、腹泻、胃肠减压和肠瘘等因消化液丢失造成低 钾.肾上腺皮质激素可促进排钾，长期应用可能引起低血钾.(3)细胞外钾转移:如静脉输入过多葡萄糖,尤其是加用胰岛素时,为促进葡萄糖 进入细胞合成糖原,钾也进入细胞内,很易造成低血钾。代谢性 碱中毒或输入过多的碱性药物，形成急性碱血症，H+从细胞内 移出到细胞外中和碱性,细胞外钾进入细胞内,造成低血钾.(4)血浆稀释也可造成低血钾症。低血钾改变了细胞内外钾含量的比例而影响神经肌肉的兴奋性，也影响细胞膜的功能，使患者出现低血钾的临床症状。最重要的是影响心肌功能，表现为室上性心动过速、心传导阻滞、室性期外收缩和室性心动过速，严重者心跳停止于收缩期。,(一)钾、钠测定,临床意义 参考值 血清钾2.高钾血症：血清钾高于5.5mmol/L(1)输入过多:如钾溶液输入过快或量过大,特别是肾功能不全、尿量减少时,又输入钾溶液,尤其容易引起高血钾症。(2)排泄障碍:如少尿或无尿,如急性肾功能衰竭。(3)细胞内钾向细胞外转移:如大面积烧伤组织细胞大量破坏，细胞内钾大量释放入血。代谢性酸中毒,血浆H+往细 胞内转移,细胞内的钾转移到细胞外。与此同时,肾小 管上皮细胞泌H+增加,泌钾减少,使钾潴留于体内。高血钾主要表现神经肌肉症状，如肌肉酸痛、苍白和肢体湿冷等一系列类似缺血现象。神经及神经肌肉联接处的兴奋性抑制,可发生心内传导阻滞,出现心跳变慢及心律不齐,引起循环机能衰竭,甚至引起纤维性颤动,最后,心脏停跳于舒张期。,(一)钾、钠测定,临床意义 参考值 血清钠:136-146mmol/L 3.低钠血症：可由钠减少或水增多引起，常见引起原因有：（1）肾性因素:有渗透性利尿、肾上腺功能低下、肾素生成 障碍以及急、慢性肾功能衰竭等。(2).非肾性因素:如呕吐、腹泻、肠瘘、大量出汗和烧伤等。除钠丢失外 还伴有水丢失，血浆渗透压降低，引起水份向细胞内转移，出现细胞水肿，严重 者可出现脑水肿。4.高钠血症:可因摄入钠过多或水丢失过多而引起。主要见于水 排出过多而无相应的钠丢失，如水样泻、尿崩症、出汗过多以及糖尿病由于水随大量糖尿排出而引起 高钠血症等。,(一)钾、钠测定,注意事项1.钠电极多采用硅酸锂铝玻璃电极膜制成，寿命较长；钾电极多采用缬氨霉素膜，需定期更换。2.ISE法误差有2类，其一是由于离子选择性电极膜的蛋白质漂浮，或由于薄膜的污染而改变了电极选择性响应造成误差；其二是电解质排斥效应引入的误差，与样品中脂类和蛋白质占体积有关。,(一)钾、钠测定,方法特点不需燃料，安全，且可与自动生化分析仪组合钠电极选择比：Na:K300：1缬氨霉素钾电极选择比：K:Na 5000：1 ISE法优点标本用量少，直接电位法可以用全血标本自动化程度较高直接ISE法，因为在血脂、蛋白变化对能真实反应临床情况，得到预期结果。,(二)氯化物测定,检测方法有：汞滴定法、分光光度法、库仑电量 分析法及最常用的ISE法。离子选择电极法（ISE）原理 氯电极是由氯化银、氯化铁-硫化汞为模性材料制成的固体膜电极，由电极基部和头部组成。头部含银-氯化银粒子，当溶液中的氯离子与电极头部表面接触时,服从能斯特方程的电动势,与参比电极相连,能测出样品中氯化物的浓度，以mmol/L表示。,(二)氯化物测定,仪器：用氯电极单一组装的分析仪已不多见，一般是由K、Na、Cl 电极3项组合或由K、Na、Cl、Ca、CO25项电极组合在一起而成。试剂：氯测定所需的试剂和定标液是与钾、钠电极应用的缓冲液和定标液组合在一起，不单独配制,(二)氯化物测定,临床意义 参考值：98-108mmol/L1.血氯增高：高氯血症性代谢性酸中毒、失水大于 失盐、注射过量生理盐水、高钠血症。2.血氯降低：代谢性碱中毒、NaCL丢失过多、摄入 减少、肾上腺皮质功能低下等。,(二)氯化物测定,注意事项1.氯电极使用久后，电极膜头上会出现黑色的物质（AgCl），此时电极灵敏度下降，需用软布将膜表面的黑色物质擦去，再用细纱纸轻轻的摩擦数次即可。2.每次测定都应同时用定值质控血清进行测定，以利于质量保证。,(二)氯化物测定,方法特点1.离子选择电极法(ISE)法是目前测定Cl-最好的方 法,因为Cl-电极总是与Na+、K+电极配套使用,仅需 要50l100l血清、血浆或全血就可测出Na+、K+、Cl-的含量。简便、快速、准确，是临床使用最多的方法。2.对标本中Cl-有特殊响应。标本中Br-和I-有一定干 扰，因量少可忽略不计。,基质及基质效应,基质:又称基体或介质，是指在分析样品中，除了分析物以外的所有其他物质和组分（包括溶剂），称为该分析物的基质。基质效应 是指检测系统在分析样品中的分析物时，处于分析物周围的基质对分析物测定结果的影响，称为基质效应。,思考题,1.测定血清总蛋白主要有哪些方法，各有何特点？2.简述双缩脲法测定血清总蛋白的基本原理及注意事项3.溴甲酚绿法和溴甲酚紫法测定白蛋白的基本原理有何异同？4.测定血清总蛋白、白蛋白有何临床意义5.简述葡萄糖氧化酶法测定血清葡萄糖的基本原理、临床意义及注意事项。6.简述离子选择性电极法测定K、Na、Cl的实验原理、注意事项及临床意义。,